بهینه سازی و بیان ژن طراحی شده stxA واجد سه جهش هدفمند (E167Q-A231D-G234E) شیگلا دیسانتری و تخلیص آن

Abstract

چکیده: هدف: شیگلا دیسانتری با تولید سم stx (با دو زیر واحد AوB) یکی از مهمترین باکتریهای بیماریزا‌ی روده ای برای انسان است. این سم با ورود به سلول های اپیتلیال باعث مهار سنتز پروتئین و مرگ سلولی خواهد شد. علیرغم مطالعات فراوان جهت تولید واکسن ، هنوز ضرورت تداوم مطالعه در دستیابی به پروتئین نوترکیب از نوع stxA وجود دارد.هدف از این مطالعه، طراحی ژن stxA موتانت و تولید پروتئین بیانی آن بعنوان کاندید واکسن علیه شیگاتوکسین جهت بررسی ایمنی زایی آن در مطالعات بعدی می باشد. روش ها: پس از طراحی و تهیه ژن سنتتیک pET28a/stxA موتانت(G234E - E167Q -A231D) ، واکنش PCR جهت کنترل صحت حضور این ژن انجام گردید. پس از انتقال این وکتور به سلول میزبان Bl21 DE3 ، بیان، بهینه سازی و نهایتا تخلیص پروتئین حاصل بررسی گردید. یافته ها: نتیجه مطالعات اولیه، منجر به طراحی ژن stxA موتانت گردید. نتایج واکنش PCR با استفاده از پلاسمید سنتتیک نشان از صحت ژن مورد مطالعه داشت. سپس بیان این ژن در سلول میزبان Bl21 DE3، بهینه سازی گردید که درنتیجه تولید مقادیر زیادی از این پروتئین به شکل اجسام توده ای نشان داده شد. تخلیص انکلوژن بادی و سپس محلول سازی پروتئین های آن از روش های تلفیقی صورت گرفت. بحث و نتیجه گیری نهایی : با توجه به مکانیسم اثر شیگاتوکسین پیش بینی می شود که این پروتئین موتانت دارای اثر سمیت کمتری نسبت به سایر موتانت های قبلی کاندید واکسن داشته باشد، در نتیجه می تواند به عنوان کاندید واکسن برتر مطرح گردد