همسانه‌سازی ژن پیروات دکربوکسیلاز مؤثر در تولید بیواتانول در باکتری اشرشیا کلای

Abstract

مقدمه: اتانول ساخته‌شده از زیست‌توده یکی از راهبردهای بی‌نظیر و سودمند از لحاظ اقتصادی و محیطی است و می‌تواند به‌عنوان یک سوخت پاک و ایمن، جایگزین سوخت‌های فسیلی شود‏. ‏‏<br /> <br /> مواد و روش‏ ‏ها: در این پژوهش کلیدی‌ترین آنزیم مؤثر در مسیر تولید اتانول زیستی (پیروات دکربوکسیلاز) از زایموموناس موبیلیس انتخاب و در اشرشیا کلای به‌روش ذوب-انجماد همسانه‌سازی شد. برای همسانه‌سازی ژن مدِنظر از آغازگرهای اختصاصی ژن پیروات دکربوکسیلاز و واکنش پی‌سی‌آر استفاده شد. سپس ژن پیروات دکربوکسیلاز و پلاسمید pET 28a را آنزیم‌های محدودکننده Sal I و Xho I برش دادند؛ محصولاتی که آنزیم لیگاز برش دادند در دمای ۱۶ درجه سانتی‌گراد و در مدت ۱۶ ساعت به همدیگر متصل شدند. ‏‏<br /> <br /> نتایج: کشت باکتری‌ها در محیط کشت LB انتخابی نشان داد که تنها کلونی‌های حاوی پلاسمید pET 28a قادر به رشد هستند. نتایج کلونی پی‌سی‌آر با آغازگرهای اختصاصی باندهایی در اندازه تقریبی ۱۷۰۰ جفت باز را نشان داد. نتایج مربوط به پی‌سی‌آر پلاسمیدهای نوترکیب توسط آغازگر رفت راه‌انداز T7 و آغازگر برگشت ژن پیروات دکربوکسیلاز، جهت صحیح درج ژن در داخل پلاسمید را ثابت کرد و باندی به‌اندازه ۱۸۸۵ جفت باز را نشان داد و نتایج هضم آنزیمی پلاسمیدpET 28a pdc نوترکیب توسط آنزیم‌های Sal I و Xho I باندهای مشابهی را آشکار کرد. درنهایت واکنش RT باند مورد انتظار ۱۷۰۰ جفت باز را نشان داد که حاکی از بیان ژن مورد نظر در این نمونه‌ها بود. ‏<br /> <br /> بحث و نتیجه‏ گیری: از مهم‌ترین مشکلات در بیوسنتز اتانول، محدودیت عملکرد آنزیم‌های درگیر در مسیر بیوسنتز اتانول از مواد اولیه نظیر ضایعات کشاورزی است؛ این آنزیم‌ها در تبدیل مواد اولیه پلی‌مری به مواد اولیه با ساختار ساده و قابل تخمیر نقش اساسی دارند. به نظر می‌رسد افزایش بیان ژن پیروات دکربوکسیلاز تحت کنترل پروموتور قوی T7 منجر به افزایش تولید محصول نهایی خواهد شد‏. ‏‏