جداسازی و تهیه ساختار Antisense ژن fae و انتقال آن به گیاه کلزا (Brassica napus)

Abstract

کلزا به عنوان یکی از مهمترین گیاهان روغنی دنیا محسوب می‌شود. کیفیت روغن حاصله از دانه کلزا به ترکیب اسیدهای چرب تشکیل دهنده آن بستگی دارد. ساخته شدن زنجیره‌های طویل اسیدهای چرب اشباع و غیراشباع دارای مراحل مختلفی می‌باشد که هر یک از این مراحل توسط آنزیم یا آنزیم‌های متعدد کنترل می‌شود. تغییر در محتوای اسیدهای چرب روغن کلزا با استفاده از روش مهندسی ژنتیک نیازمند شناسایی، جداسازی و دستورزی در ژنهای درگیر در بیوسنتز اسیدهای چرب می‌باشد. اسید اروسیک (C22:1) یکی از مهمترین اسیدهای چرب تأثیر گذار بر کیفیت روغن کلزا می‌باشد، بطوریکه میزان بیشتر از 2 درصد آن باعث کاهش شدید کیفیت روغن خوراکی کلزا می‌گردد. تحقیقات نشان داده است که آنزیم -ketoacyl-CoA synthase(KCS) ? آنزیم کلیدی در بیوسنتز اسید اروسیک می‌باشد. این آنزیم توسط ژن fae (Fatty Acid Elongase) تولید می‌شود که تبدیل شدن اسید چرب C18 به C20 و C22 را عهده‌دار است. در این تحقیق جداسازی، همسان سازی، تهیه ساختار ژنی آنتی‌سنس و انتقال ژن سنتز کننده این اسید چرب به گیاه کلزا مورد بررسی قرار گرفت و به منظور خاموش نمودن ژن فوق و جلوگیری از سنتز اسید اروسیک، سازه آنتی‌‌سنس از این ژن (fae) تهیه شد. بدین منظور DNA ژنومی گیاه کلزا به روش CTAB استخراج و با طراحی یک جفت آغازگر و استفاده از روش PCR، ژن مورد نظر جدا گردید. قطعه 1521 جفت بازی حاصل از تکثیر ژن با استفاده از هضم آنزیمی توسط آنزیمهای محدود‌گر EcoRV)و (HindIII آنالیز و مورد تأیید قرار گرفت. به منظور تأیید نهایی، ژن جداسازی شده در ناقل عمومی pSK کلون و با استفاده از آغازگرهای استاندارد تعیین توالی گردید و صحت آن مورد تأیید مجدد قرار گرفت. با توجه به هدف تحقیق که کنترل میزان تولید اسید اروسیک می‌باشد، سازه‌‌ آنتی سنس ژن fae در جایگاه همسان سازی پلاسمید بیانی گیاهی pBI121 همسانه‌سازی شد. پلاسمید pBI121 نوترکیب به باکتری Agrobacterium tumefacience سویه LBA4404 وارد و از آن به منظور تولید سلولهای تراریخت و تولید گیاه تراریخت استفاده گردید. با وجود رشد گیاهان روی محیط حاوی کانامایسین از PCR با آغازگرهای اختصاصی، لکه گذاری نقطه‌ای و آنالیز سادرن برای تأیید انتقال ژن مورد مطالعه استفاده شد. خاموش شدن ژن fae توسط ساختار آنتی‌سنس منتقل شده باعث کاهش قابل ملاحظه میزان اسید اروسیک در گیاهان تراریخت B. napus گردید.