استفاده از تکنیکqPCR به منظور شناسایی سویه های کدکننده توکسین کلستریدیوم دیفیسیل

Abstract

کلستریدیوم ‌دیفیسیل (Clostridium difficile)، باکتری گرم ‌مثبت، بی‌هوازی و اسپوردار بوده و عامل گاستروآنتریتوکولیت با غشاءکاذب است. هنگامی که میکروفلور طبیعی روده، توسط فاکتورهای خطر، مانند درمان با آنتی‌بیوتیک‌ها، شیمی‌‌درمانی و غیره آشفته می‌شود،کلستریدیوم دیفیسیل فرصت تکثیر یافته و باعث بیماری می‌شود. عوامل اصلی بیماری‌زایی این باکتری، دوتوکسینB وAهستند،که توسط ژن‌هایtcdA وtcdB کد می‌شوند. هدف از این تحقیق توسعه روش qPCR به منظور شناسایی عفونت کلستریدیوم‌دیفیسیل از طریق طراحی پرایمرهای اختصاصی برای ژن‌هایtcdAو tcdB می‌باشد. در این مطالعه ابتدا با بررسی دقیق نواحی حفاظت‌شده در توالی ژن‌هایtcdAو tcdB، دو جفت پرایمر برای تکثیر اختصاصی نواحی مورد نظر طراحی‌شد. سپس بهینه‌سازی روش qPCRبا استفاده از این پرایمرها انجام‌شد. حساسیت روش با استفاده از غلظت-های مختلف DNA باکتری مورد ارزیابی قرارگرفت. علاوه براین، به منظور بررسی اختصاصیت روش از DNA باکتری‌های مولد اسهال (اشرشیاکلی، شیگلا دیسانتری، سالمونلا تیفی و یرسینا انتروگلیتیکا) استفاده شد. در نهایت عملکرد روش بهینه‌سازی-شده با تعداد 100 نمونه بالینی مورد ارزیابی قرارگرفت. حساسیت روش به میزان pg100از DNA و اختصاصیت روش بهینه-سازی شده 100% تعیین شد. در نمونه‌های بالینی مورد مطالعه با روش بهینه‌سازی شده 9 مورد مثبت شناسایی شد. با توجه به نتایج بدست آمده استفاده از پرایمرهای اختصاصی برای ژن‌هایtcdA و tcdB می‌تواند به عنوان رویکرد مناسبی برای شناسایی سریع و دقیق عفونت C. difficile در تکنیک qPCR مورد استفاده قرارگیرد.