شناسایی، همسانه سازی، تعیین توالی ژن virG و ایجاد سویه بومی تخفیف حدت یافته virGΔ با استفاده از سیستم λ Red recombinase

Abstract

باکتری شیگلا و سویه های اشرشیا کلی مهاجم روده ای (EIEC) جزء خانواده با کتریهای گرم منفی و عامل مسری ترین اسهال باسیلی (شیگلوز) می باشند. ژن <em>virG</em> یکی از فاکتور های ضروری در آسیب زایی باکتری شیگلا است. پروتئین رمزگذاری شده توسط این ژن، بر روی غشای خارجی (OM) شیگلا قرار گرفته و به خانواده پروتئینهای خود منتقل شونده AT (Autotrnasporter) خارج سلولی در باکتریهای گرم منفی تعلق دارد. یکی از روشهای ساخت واکسنهای شیگلا ایجاد تخفیف حدت در سویه های وحشی از طریق جهش زایی در ژنهای ویژه آسیب زایی باکتری می باشد. هدف از این مطالعه شناسایی، همسانه سازی و تعیین توالی ژن <em>virG</em> و ایجاد سویه زنده تخفیف حدت یافته <em>virG</em>Δ با استفاده از سیستم λ Red recombinase در سویه <em>شیگلا دیسانتری</em> تیپ1 جدا شده از مبتلایان به شیگلوز بود. در ابتدا با استفاده از آزمایش سرم شناسی و واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)، گونه و سرووار شیگلای جدا شده از بیمار مورد بررسی و تأیید قرار گرفت. با توجه به اطلاعات موجود در پایگاه داده های ژنومی (NCBI)، آغازگرهای شناسایی ژن <em>virG</em><em> </em>طراحی و پس از تکثیر این ژن، در حامل pGEM-7zf همسانه سازی و توالی یابی با استفاده از آغازگر های عمومی حامل انجام گردید. سویه مذکور توسط پلاسمید کمکی pKD46 (حامل ژنهای لازم برای القای نوترکیبی تحت پروموتور آرابینوز) با روش شوک الکتریکی تراریخت گردید. بعد از طراحی آغازگر های ویژه القای نوترکیبی، واکنش PCR با استفاده از حامل pKD3 (دارای کاست کلرامفنیکل که با توالیهای FRT همجوار شده است) اجرا شد. تراریخت سازی کاست آنتی بیوتیکی پس از خالص سازی، در سویه شیگلا بومی حامل pKD46 با استفاده از روش شوک الکتریکی انجام شد. سویه جهش یافته با جایگزینی کاست کلرامفنیکل با ژن <em>virG</em> از طریق وقوع نوترکیبی هومولوگ به دست آمد. سپس کاست آنتی بیوتیکی با به کارگیری پلاسمید کمکی pCP20 (حامل آنزیم FLP ریکامبیناز) از طریق جایگاه های FRT حذف گردید. صحت فرآیند از طریق بررسی خصوصیات فنوتیپی (رشد سویه مقاوم به کلرامفنیکل) و ژنوتیپی (واکنش PCR با آغازگر های خارجی و سپس توالی یابی محصول آن) مورد تأیید قرار گرفت. نتایج به دست آمده حاصل از تعیین توالی ژن <em>virG</em> در مقایسه با سویه استاندارد (با شماره دسترسیCP000035)، هم خوانی کامل (100 درصد) را تأیید نمود. اطلاعات حاصل ازآنالیز بیوانفورماتیکی حذف 3220 جفت باز از ژن <em>virG</em> را در سویه جهش یافته نشان داد. استفاده از سیستم λ Red recombinase ایجاد جهش را تسهیل و در مقایسه با سایر روشها مانند حاملهای انتحاری، روشی مؤثر و ارزان تر می باشد.