ردیابی ویروئیدهای مرکبات با روش استخراج اسید نوکلئیک توسط CF-11

Abstract

بیماری‌های کاچکسیا ناشی از ویروئید<em>Citrus Cachexia viroid</em>, CCaVd <em> </em>و اگزوکورتیس ناشی از ویروئید <em>Citrus exocortis viroid</em>, CEVd مهم‌ترین بیماری‌های ویروئیدی مرکبات در جهان هستند. ویروئیدها با روش‌های متداول سرولوژیکی قابل شناسایی نبوده و روش‌‌های فعلی تشخیص آنها عموماً وقت‌گیر، پر هزینه و با محدودیت‌‌هایی همراه است. در این بررسی امکان خالص‌سازی و شناسایی دقیق این ویروئیدها با استفاده از ستون کروماتوگرافیCF-11 بررسی شد. طی سال‌های1390 تا 1392، از سرشاخه‌های22 درخت نارنگی و 15 درخت پرتقال به ترتیب واجد علائم بیماری‌های کاچکسیا و اگزوکورتیس در شرق مازندران نمونه برداری شد. بافت برگ پس از پودر شدن با بافر استخراج مخلوط شد. خالص‌سازی در ستون حاوی پودر سلولز انجام و با افزودن اتانول، مولکول‌های آر ان ای دو رشته‌ای استخراج و توسط استات سدیم رسوب داده شد. رسوب حاصل در آگارز یک درصد الکتروفورز و دو باند اختصاصی در محدوده‌های 300 تا 400 جفت باز (فرم خطی) و7800 -7000 جفت باز (فرم حلقوی) مرتبط با این دو ویروئید به دست آمد که به ترتیب در ماه‌های گرم و در تمامی ماه‌های سال با این روش قابل‌شناسایی بود. ماهیت RNA دورشته‌ای باندهای به ‌دست آمده، با عدم تخریب آنها توسط آنزیم ‌DNase وهمچنین RNase در حضور محلول نمک طعام 0.3 مولار و حلالیت آن‌ها در محلول LiCl تایید شد. ماهیت ویروئیدی باندهای به دست آمده توسط واکنش زنجیره‌ای پلی مراز (RT-PCR) با استفاده از آغازگرهای اختصاصی CEVd و CCaVd تعیین گردید. تعداد 500 نهال پرتقال و 300 نهال نارنگی در آزمون سلامت نهال با این روش بررسی شد.با توجه به تکرار پذیری و قابل اعتماد بودن این روش و تأیید ماهیت باندهای به دست آمده با آغازگر اختصاصی هر یک از این دو ویروئید در واکنش زنجیره ای پلی‌مراز، این روش برای تشخیص ویروئیدهای مرکبات در برنامه‌های کاربردی تولید نهال سالم با صرف حداقل زمان و هزینه پیشنهاد می‌گردد.