ردیابی اختصاصی Phytopthora inundata از طریق واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ساده و تودرتو

Abstract

گونة <em> Phytophthora inundata</em>به تازگی توصیف شده و به علت خصوصیات ریخت‌شناختی و حداکثر دمای رشد غیرعادی، شناسایی آن دشوار است. این گونه با سایر گونه‌های بیمارگر گیاهی جنس <em>Phytophthora</em>که بدون پاپیل و گرماپسند هستند، اشتباه می‌شود. در این بررسی برای شناسایی <em>P. inundata</em>شیوه‌ای براساس واکنش زنجیره‌ای پلیمراز ساده و تودرتو ابداع شد. بدین منظور مجموعه‌ای از جدایه‌ها مربوط به میزبان‌های مختلف که نمایندة تنوع موجود در توالی نواحی رمزگذار و فاقد رمزِ این گونه بودند، مورد بررسی قرار گرفت. براساس توالی‌های جداکنندة نسخه‌برداری شدة داخلی یک و دو و ژن 8/5 اس مربوط به دی‌اِن‌اِی ریبوزومی (آی‌تی‌اِس)، ژن پروتئین مقاوم به شوک حرارتی 90، ژن‌های پروتئین پیوستة تریوزفسفات ایزومراز/گلیسرآلدئید سه فسفات دی هیدروژناز و هم‌چنین ژن پروتئین 60 اس ریبوزومی ال 10، برای گونة مذکور ده عدد آغازگرِ واکنش زنجیره‌ای پلیمراز اختصاصی طراحی گردید. برای ایجاد بیشترین اختصاصیت و کارآیی، دمای جفت‌شدگی و زمان گسترش برای هر جفت آغازگر بهینه‌سازی گردید. برای ارزیابی آغازگرها از 28 گونة دیگر فیتوفتورا که از نظر ریخت‌شناختی و مولکولی تأیید شده بودند، استفاده شد. در اغلب موارد هیچ‌یک از مجموعه آغازگرها قادر به فزون‌سازی دی‌اِن‌اِی خالص‌سازی شده از گونه‌های <em>Phytophthora</em> غیرخودی نبودند. واکاوی‌ها نشان داد که بهترین نامزد برای شناسایی جدایه‌های <em>P. inundata</em> مجموعة ITS-I1 می‌باشد که از ترکیب آغازگرهای ITS-IF1 و ITS-IF2 تشکیل شده است. دمای جفت‌شدگی بهینه برای این مجموعه 69 درجة سانتی‌گراد و بهترین زمان گسترش 40 ثانیه می‌باشد. به نظر می‌رسد استفاده از واکنش زنجیره‌ای تودرتو با استفاده از مجموعة ITS-I1 به همراه آغازگرهای عمومی ITS4 و ITS6 به عنوان آغازگرهای خارجی حداقل 50 برابر حساس‌تر از روش سنتی است.