مکان‌یابی رونوشت ژن Vasa در بافت بیضه ماهی آزاد دریای خزر (Salmo caspius) با شیوه دورگه‌سازی در محل (In Situ Hybridization)

Abstract

دورگه‌سازی در محل، ابزار قدرتمندی در مکان‌یابی توالی خاصی از اسید­های نوکلئیک در جمعیت ناهمگونی از سلول­ها است. از این رو، مطالعه حاضر با هدف راه‌انداری این شیوه، با استفاده از نشانگر Vasa در بافت بیضه ماهی آزاد دریای خزر (Salmo caspius) انجام شد. برای انجام این مطالعه، ریبوپروب نشاندار شده با دیگوکسی ژنین (Dig) از پلازمید pGEM-T حامل DNA مکمل ژن Vasa ماهی آزاد دریای خزر، تولید شد. نشاندار کردن RNA طی واکنش رونویسی در شرایط آزمایشگاهی با استفاده از Dig Labeling Mix انجام شد. برای دورگه‌سازی در محل بر روی بافت، ابتدا بافت بیضه بعد از جداسازی از ماهی آزاد نابالغ، تحت تثبیت و آب‌گیری بافتی قرار گرفت. پس از آب‌دهی مجدد و تیمار با پروتئیناز K، لام­ها با بافر دورگه‌سازی، حاوی ریبوپروب آنتی‌سنس Vasa انکوبه شدند. پس از شستشو با محلول SSC و انکوباسیون با آنتی‌بادی علیه دیگوکسی ژنین برای 16 ساعت، آشکارسازی با NBT/BCIP انجام شد. نتایج به دست آمده از این پژوهش با استفاده از ریبوپروب آنتی‌سنس Vasa نشان داد که همه سلول­های زایا (از سلول­های بنیادی اسپرماتوگونی تا اسپرماتوزوآ) این ژن را به خوبی بیان کردند، اما شدت بیان آن در رده‌­های مختلف سلول­های زایای گونه مورد مطالعه، متفاوت بود. بنابراین در این مطالعه، ژن Vasa به عنوان نشانگر اختصاصی برای سلول‌­های زایا در این ماهی و شیوه دورگه­سازی در محل به عنوان یک عامل کاوشگر، به منظور بررسی مکان رونوشت ژن‌ها در بافت بیضه ماهی آزاد، معرفی شد. این یافته می‌تواند کمک شایانی در شناخت بیشتر ما از چگونگی تشکیل سلول­های زایا و تکوین آن­ها در این گونه ارزشمند دریای خزر داشته باشد.