بیان فاکتور رونویسی دوپامینرژیکی Nurr1 در سلول‏های انسانی به‏وسیله لنتی ویروس‏های نوترکیب

Abstract

<strong>هدف:</strong> هدف این تحقیق تولید لنتی ویروس‏های حامل ژن Nurr1 و بیان در سلول‏های انسانی می‏باشد. <strong>مواد و روش‏ها</strong>: قطعه ژنی IRES-EGFP با آنزیم‏های Bgl ll/Not1 از ناقل pIRES2-EGFP جدا و با Klenow کور (Blunt) گردید. ناقل لنتی ویروسی pNL-EGFP/CMV/WPREdU3 با آنزیم‏های Nhe1/ Xho1 برش و دو سر آن کور شد. قطعه ژنی ایزوله شده به این ناقل منتقل شد تا سازه لنتی ویروسی (I) به‏وجود آید. سپس ژن Nurr1 با آنزیم‏های Xho1 و BamH1 از ناقل PCMX-NOT بریده و درون پلاسمید (I) خطی شده باSal1 و BamH1 منتقل شد تا سازه نهایی لنتی ویروسی (II) تولید گردد. برای تولید لنتی ویروس‏های نوترکیب، رده سلول انسانی HEK-293T را با این پلاسمید نهایی، به‏همراه پلاسمیدهای غشایی و بسته بندی لنتی ویروس ترانسفکت شد. محیط این سلول‏ها که مملو از ذرات ویروسی شده بود جمع آوری و از ستون آمیکون عبور داده شد تا ذخیره غلیظ ویروس به‏دست آید. این ذخیره برای آلوده سازی سلول‏های هدف استفاده شد. بیان EGFP در زیر میکروسکوپ به اثبات رسید و بیان ژن Nurr1 با RT-PCR سنجیده شد. <strong>نتایج:</strong> درستی مراحل کلونینگ با آنزیم‏های مربوطه اثبات شد. با میکروسکوپ فلورسنس بیان Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) در هر دو مرحله ترانسفکشن و ترانسدوکشن ثابت گردید. تکنیک RT-PCR بیان Nurr1 را در هردو مرحله به اثبات رسانید. <strong>نتیجه گیری:</strong> لنتی ویروس‏های ناقل ژن انسانی Nurr1 تولید شده و به‏دنبال آلوده سازی سلول‏های انسانی HEK-293T با ویروس‏های مزبور، سلولهای فوق ژن Nurr1 را به‏طور موفقیت آمیز بیان کردند.