ذخیره سازی طولانی سوسپانسیون سلولی چند رقم برنج(Oryza sative L.) ایرانی به عنوان ژرم پلاسم در مافوق سرما

Abstract

نگهداری مواد ژنتیکی در مافوق سرما تکنیکی است که در بسیاری از مراکز تحقیقاتی دنیا برای نگهداری ژرم پلاسم گیاهی در مدت زمان طولانی از آن استفاده می نمایند. جهت استفاده این تکنیک در نگهداری ژرم پلاسم برنج، آزمایشی انجام شده تا دریافته شود سوسپانسیون سلولی را حداکثر چه مدت می توان با حفظ باززایی آن در مافوق سرما نگهداری نمود؟ برای این منظور ابتدا در محیط کشت LS2.5 از بذور سه رقم برنج ایرانی (آمل -3 ، خزر و طارم ) کالوس تولید شد. جهت ذخیره کردن سوسپانسیون سلولی در ازت مایع ، سلول ها را در محیط کشت های مایع AA2 و R2 به مدت 3 الی 4 روز وا کشت نموده سپس 2/0 گرم از این سلولها به داخل ظروف کوچک از جنس پولی پروپیلن انتقال داده و همزمان 75/0 سانتی متر مکعب از مخلوط مواد 342.3 g/l ، Sucrose؛ 39 g/l PH 8.5 ، DMSO؛ 46 g/l، Glyserol همراه با پرولین 5 گرم در لیتر اضافه نموده تا سوسپانسیون سلولی بتواند سرمای زیاد را تحمل نماید . بعد از این عمل ظروف حامل سلول ها را به مدت یک ساعت در داخل یخ نگهداری یخ نگهداری نموده وسپس آنها را در داخل ظروف آلومینیومی گذاشته تا به داخل ازت مایع انتقال داده شود. جهت انتقال به داخل تانک ازت مایع ابتدا به مدت 35 دقیقه در دمای منهای 35 درجه سانتی گراد نگهداری و بعد از آن در مافوق سرما (-196 درجه سانتی گراد) به مدت دوازده ماه نگهداری گردید. بعد از یک سال ظروف از ازت مایع بیرون آورده شد و بلافاصله در داخل آب گرم سترون 45 درجه سانتی گراد برای مدت یک تا دو دقیقه نگهداری شد. بعد از اینکه سلول ها از یخ زدگی به حالت اولیه برگشت مواد اضافه شده با پیپت جدا شده و سلول ها بر روی محیط کشت نیمه جامد R2 و AA2 که روی آن دو فیلتر از نوع واتمن گذاشته شده بود، کشت گردید و در دمای 1 درجه سانتی گراد +26 و -26 و در تاریکی نگهداری شد. نتیجه این مطالعه نشان داد که بعد از دوازده ماه نگهداری سلول ها در مافوق سرما مجدداً برای همه رقم ها سوسپانسیون سلولی تشکیل شد. سوسپانسیون سلولی تشکیل شده برای تولید پروتوپلاست استفاده گردید. ارقام آمل -3 و طارم در مقایسه با شاهد تقریباً دو برابر افزایش تولید پروپلاست داشته ولی رقم خزر در مقایسه با شاهد 20% افزایش داشته است. همچنین در مقایسه باززایی پروتوپلاستها با پروتوپلاست های شاهد نتایج نشان داد که ارقام آمل -3 و خزر به طور معنی داری کاهش باززایی داشته اما برای رقم طارم در مقایسه با شاهد اختلاف معنی داری مشاهده نشده است. در این آزمایش به ترتیب برای ارقام آمل -3 ، خزر و طارم تعداد 24 ، 32 و 49 گیاه سبز به دست آمده است.