طراحی و ساخت ناقل بیانی گیاهی واجد ژن نشانگر مقاومت به آنتی‌بیوتیک هیگرومایسین

Abstract

ناقلین دوتایی مرسوم مبتنی بر pBI121 که هنوز به طور گسترده‌ای در انتقال ژن به گیاه به‏‌‏وسیله آگروباکتریوم استفاده می‌شوند،‌ به‌علت عدم کارآیی گزینش‌گر کانامایسین، در برخی از گیاهان تک‌لپه‌ای‌ قابل استفاده نیستند در حالی که مقاومت به هیگرومایسین یک نشانگر گزینشی پرکاربرد و مهم در تراریختی برخی گیاهان به‌ویژه تک‌لپه‌ای‌ها به شمار می‌رود. از این رو در مطالعه حاضر، بهبود ناقل‌ pBI121 برای تراریختی گیاهان تک‌لپه‌ای مورد نظر قرار گرفت. به این منظور، ژن مقاومت به هیگرومایسین به همراه خاتمه‌دهنده 35S از پلاسمید p6-ubi-rnai به‏‌‏وسیله آنزیم‌های برشی SmaІ‌ و NotІ، جداسازی و در ناقل حدواسط pBlueScript همسانه‌سازی شد. در ادامه، با استفاده از آنزیم‌های HindIII و SmaI، پیش‌بر CaMV 35S از بدنه حامل pBI121 جداسازی و در بالادست این ژن در ناقل pBlueScript قرار داده شد. با استفاده از آنزیم‌های HindIII و Eco53KI، کاست کامل ژن مقاومت به هیگرومایسین جایگزین کاست ژن مقاومت به کانامایسین (که با استفاده از آنزیم‌های HindIII و MssI حذف شده بود) در ناقل pBI121 شد. صحت ساخت ناقل جدید توسط روش PCR، بررسی الگوی هضم آنزیمی و توالی‌یابی تأیید شد. با توجه به محبوبیت سری ناقلین مبتنی بر pBI121 نسبت به سایر ناقلین موجود و آشنایی محققین با نحوه دستورزی آنها، کارایی ناقل معرفی شده در این مطالعه می‌تواند در پژوهش‌های انتقال ژن به گیاهان تک‌لپه مورد بررسی قرار گیرد.