کلونینگ و بیان ژن اینترفرون آلفاb2ی انسانی در سیستم بیانی اشرشیاکلی

Abstract

<strong>زمینه و هدف: </strong>اینترفرون‌ها وسیلة دفاعی بدن علیه ویروس‌ها هستند که به سرعت در بدن تولید شده، سلول­های اطراف را به تولید پروتئین‌هایی که تکثیر ویروس را مهار، یا پاسخ ایمنی و رشد سلولی را کنترل می‌کنند، تحریک می‌کنند. با ‌توجه به اهمیت دارویی اینترفرون آلفا b2 انسانی در ایران و جهان، تولید این دارو در داخل کشور و از طریق بیوشیمیایی امکان‌پذیر اما بسیار مشکل می‌باشد. زیرا تولید این پروتئین توسط سلول‌های سالم بسیار کم انجام می‌شود. هدف‌ از این تحقیق، همسانه‌سازی (Cloning) و بیان ژن اینترفرون آلفا b2 انسانی در باکتری اشرشیاکلی در یک سیستم بیانی مناسب جهت امکان هدایت پروتئین تولید‌شده به فضای پریپلاسمی باکتری است. بیان در پریپلاسم، فضای عالی برای تشکیل پیوند‌های صحیح و پیچش صحیح ایجاد می‌کند. ناخالصی پروتئین و فعالیت پروتئازها در پریپلاسم کمتر از سیتوپلاسم است و تخریب و تجزیه پروتئین‌ها در پریپلاسم کمتر اتفاق می‌افتد.<br /> <strong>روش بررسی:</strong> ژن اینترفرون آلفاb2 پس از تکثیر با آغازگرهای اختصاصی در ناقل بیانی (+)pET-26b تحت کنترل پروموتور T7 و پپتید نشانه پریپلاسمی pelB و با استفاده از آنزیم‌های برشی NcoI و XhoI کلون گردید و به باکتری اشرشیاکلی سویه (DE3)BL21 منتقل گردید. همسانه‌سازی ژن اینترفرون ‌آلفا در ناقل بیانی pET-26b(+) با استفاده از Colony PCR، هضم آنزیمی و تعیین توالی، تأیید شد. سپس بیان ژن اینترفرون ‌آلفا با استفاده از آنالیز بلات نقطه‌ای در فضای پریپلاسمی و به­صورت پروتئین کل در زمان­های مختلف پس از القاء با IPTG مورد‌ بررسی قرار گرفت.<br /> <strong>یافته‌ها: </strong>با استفاده از آنالیز بلات نقطه­ای تأیید شد که پروتئین نوترکیب اینترفرون آلفاb2 در سیستم بیانی اشرشیاکلی تولید و وارد فضای پریپلاسمی باکتری شده است.<br /> <strong>نتیجه­گیری:</strong> این تحقیق می­تواند امکان تولید پروتئین مهم اینترفرون آلفاb2 انسانی نوترکیب را در شکل صحیح خود و با صرف هزینه‌های بسیار پائین‌تر فراهم آورد.