همسانه‌سازی و انتقال ژن لوسیفراز حشره شبتاب گونه ایرانی Lampyris turkestanicus به گیاه توتون

Abstract

" کشاورزی مولکولی" به تولید پروتئین‌های دارویی و آنزیم‌های صنعتی توسط گیاهان از طریق مهندسی ژنتیک اطلاق می‌شود. آنزیم لوسیفراز حشره شبتاب یکی از مهم ترین آنزیم‌های صنعتی است که به طور وسیعی در زمینه‌های مختلف بیوتکنولوژی و بیولوژی سلولی و مولکولی بویژه در تشخیص میزان ATP به منظور تشخیص آلودگی‌های میکروبی، تهیه کیت‌های تشخیص سرطان، غربالگری داروها، زیست‌حسگرها، همچنین در بررسی‌ روابط برهمکنشی و تاخوردگی پروتئین‌ها، سنجش‌های آنزیمی و توالی‌یابی DNA (Pyrosequencing) استفاده می‌شود. ژن لوسیفراز نیز به عنوان ژن گزارشگر ایده‌آل در مهندسی ژنتیک به منظور بهینه‌سازی سیستم انتقال ژن، کاربرد فراوان دارد. تحقیق حاضر جهت همسانه‌سازی، انتقال ژن لوسیفراز حشره شبتاب گونه ایرانی (Heyden)L. turkestanicus و تولید آن در گیاه توتون انجام گرفت. برای این منظور آغازگرهای مناسب با توجه به توالی‌های دو انتهای ژن لوسیفراز (luc)، محل‌های برشی مناسب و توالی‌ افزایش‌دهنده بیان گیاهی (Kozak sequence)طراحی و ژن مورد نظر پس از جداسازی، در ناقل بیانی pCAMBIA1304 همسانه‌سازی شد. این ژن تحت کنترل پیشبرنده CaMV35S و خاتمه‌دهنده NOS قرار دارد. به منظور اطمینان از همسانه‌سازی، سازه تهیه‌شده با استفاده از بررسی‌هایColonyPCR،PCR، هضم آنزیمی، توالی‌یابی و همردیف‌سازی آن در بانک اطلاعاتی (GenBank)، مورد تایید قرار گرفت. سپس سازه تهیه‌شده به کمک باکتری آگروباکتریوم سویه LBA4404 به گیاهان توتون منتقل گردید و گیاهان تراریخت بر روی محیط‌های کشت انتخابی حاوی آنتی‌بیوتیک‌های هیگرومایسین و سفوتاکسیم باززایی شدند. بررسی مولکولی PCRبا استفاده از آغازگرهای اختصاصی بر روی DNA ژنومی گیاهان تراریخت و شاهد، انتقال ژن لوسیفراز را به گیاهان باززایی‌شده تایید نمود.