تولید آنزیم لوسیفراز ایرانی جهش‌یافته به روش SDM با کاربرد تشخیص بالینی

Abstract

مقدمه: آنزیمی که واکنش بیولومینسانس یا نشر نور را در تعدادی از موجودات کاتالیز می‌کند لوسیفراز نام دارد. از واکنش کاتالیز شده توسط این آنزیم می‌توان در بسیاری از سنجش‌های تشخیص طبی ازجمله سنجش مقدار ATP در محیط، کیت‌های تشخیصی بر پایه لوسیفراز، تعیین مقدار آلودگی میکروبی در یک محیط، ساخت بیوسنسورها و گزارشگرهای زیستی استفاده نمود. در جهت پایدارسازی آنزیم با کمک روش جهش‌زایی هدف‌دار، لوسیفراز های نوترکیب مختلفی ساخته‌شده‌اند. یکی از این آنزیم‌ها با جهش L300R بر جهش‌یافته ERR (E354RR356) لوسیفراز ایرانی L.turkestanicus به‎دست آمد که جهش‌یافته LRR (ERR/L300R) نام‌گذاری شد. این آنزیم اگرچه نسبت به آنزیم طبیعی به حرارت مقاوم‌تر بود، اما تقریباً غیرفعال بود. هدف از انجام این تحقیق ارزیابی امکان فعال‌سازی مجدد آنزیم غیرفعال شده LRR با کمک روش جهش‌زایی هدف‌دار جهت استفاده از آنزیم‌های جهش‌یافته در ساخت کیت‌های سنجش ATP و دیگر آزمایش‌های زیستی بوده است. مواد و روش‌ها: در این تحقیق با روش جهش‌زایی هدف‌دار اسیدآمینه گلوتامات 270 در آنزیم LRR به آلانین تبدیل شد. سپس مطالعات سینتیکی آنزیم انجام شد و خصوصیات ساختاری جهش‌یافته فوق نیز به‌وسیله تکنیک‌های فلورسنت و CD بررسی گردید. یافته‌ها: نتایج بررسی‌های سینتیکی نشان داد که آنزیم جهش‌یافته 270 فعال‌تر از LRR می‌باشد. همچنین مطالعات ساختاری نشان داد که آنزیم فوق هم از لحاظ ساختارهای دوم و هم ساختار سوم پروتئین، تغییرات عمده‌ای نموده است. نتیجه‌گیری: با جهشی که در جهش‌یافته 270 اعمال و سبب فعال‌تر شدن نسبی آن در مقایسه با LRR شد، پیشنهاد می‌شود بتوان از آنزیم 270 در ساخت کیت‌های سنجش بالینی استفاده نمود.