توسعه روش مؤثر باززایی و ترانسفورماسیون توتون از طریق بهینه سازی غلظت تنظیم کننده های رشد و ساکارز

Abstract

گیاه توتون یک بیوراکتور بسیار کارا به منظور تولید پروتئین‌های نوترکیب می‌باشد، لذا در این پروژه تحقیقاتی علاوه بر بهینه‌سازی سیستم کشت بافت این گیاه، فرآیند مناسب انتقال ژن به آن نیز مورد بررسی قرار گرفت. بدین منظور اثرات غلظت‌های مختلف ساکارز و 4 ترکیب متفاوت هورمونی (BAP و NAA) روی القا کالوس، شاخه‌زایی مستقیم و ریشه‌زایی در قالب طرح کامل تصادفی به صورت فاکتوریل و با سه تکرار مورد آزمایش قرار گرفت. حساسیت ریزنمونه‌های توتون به آنتی‌بیوتیک کانامایسین با کشت ریزنمونه‌ها روی محیط انتخابی دارای غلظت‌های مختلف کانامایسین ارزیابی شد. برای انتقال ژن از اگروباکتریوم (Agrobacterium tumefacien) سویه GV3101 حاوی پلاسمید pBI121 استفاده شد و روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) جهت بررسی گیاهان تراریخته مورد استفاده قرار گرفت. نتایج تجزیه واریانس و مقایسه میانگین نشان داد که بالاترین میزان القا کالوس با استفاده از محیط کشت M1 (حاوی 1/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و 1 میلی‌گرم در لیتر BAP) با غلظت 15 گرم در لیتر ساکارز حاصل شد. در صورتی‌که تعداد بالای شاخه‌زایی مستقیم در محیط کشت M1 با غلظت 30 گرم در لیتر ساکارز بدست آمد. بیشترین فراوانی ریشه‌زایی نیز توسط 1/0 میلی‌گرم در لیتر NAA و 60 گرم در لیتر ساکارز حاصل شد. غلظت 50 میلی‌گرم در لیتر کانامایسین بطور کامل از باززایی نمونه‌های غیرتراریخته ممانعت کرد و بنابراین از این غلظت در محیط کشت انتخابگر استفاده شد. در نهایت، قطعهbp 798 مربوط به ژن nptII در ژنوم گیاهان تراریخته توتون تأیید شد و کارایی تراریختگی با استفاده از روش اگروباکتریوم بیش از 95 درصد محاسبه گردید. تکنیک باززایی مستقیم و انتقال ژن مطرح شده در این تحقیق جهت وارد کردن ژن‌های خارجی مختلف به ژنوم گیاه توتون بسیار کارا و مؤثر می‌باشد.