طراحی بیوانفورماتیکی و ساخت کاست ژنی دربردارنده‌ی ژن‌های blf1، ctxB و stxB

Abstract

مقدمه باکتری بورخولدریا سودومالئی، ویبریوکلرا و شیگلا دیسانتری عامل بیماری میلوئیدوزیس، وبا و شیگلوز در انسان می­باشند. پروتئین­های BLF1 مربوط به B. pseudomallei، ­CTxB ویبریوکلرا و StxB شیگلا دیسانتری خاصیت آنتی­ژنیک، ادجوانتی مخاطی، حاملی و ایمنی‌زایی دارند. هدف این مطالعه، ساخت کاست ژنی دربردارنده­ی ژن­های blf1، ctxB وstxB و بیان­ پروتئین آن­ها در E. coli می­­­باشد. مواد و روش­ها با استفاده از نرم­افزار­های بیوانفورماتیک Protparam و Modeller، حالت­های مختلف پروتئین کایمریک ژن­های مربوطه بررسی شد. ساختار دوم پروتئین و اپی­توپ­های خطی و ساختاری نیز تعیین گردید. ژن‌های blf1 و stxB از پلاسمید pET28a-BLF1-STxB، PCR و قطعه 850 جفت بازی BLF1-STxB با جایگاه­های آنزیمی NotI وSalI در وکتور بیانی pET28a-CTxB زیرهمسانه­سازی و به باکتری E. coli سویه­ی BL21(DE3) ترانسفورم شد. پس از توالی‌یابی، بهینه‌سازی بیان ژن سنتزی تحت القایIPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside) و درجه حرارت 25 درجه سانتیگراد انجام و بوسیله تکنیک SDS-PAGE مورد ارزیابی قرار گرفت. یافته­ها شاخص ناپایداری پروتئین کایمر برابر با 06/40 و نیمه­عمر آن در E. coli بیش از 10 ساعت به دست آمد. شاخص سازگاری کدون سازه­ی کایمر به 9/0 و محتوای GC آن به 9/54 درصد افزایش یافت. بهترین ترتیب ممکن برای ساخت واکسن نوترکیب، ممزوج سه­تایی CTxB-BLF1-STxB بدست آمد. بیان پروتئین نوترکیب از ژن سنتزی تحت القای IPTG، منجر به تولید پروتئینی با وزن مولکولی 48 کیلودالتون شد. نتیجه­گیری با توجه به توانایی توقف پروتئین­سازی BLF1، خاصیت حاملی STxB و خاصیت ادجوانتی CTxB، قرار دادن این سه ژن در یک کاست ژنی به بهترین حالت، می­تواند به عنوان یک کاندید واکسن مناسب مورد توجه قرار گیرد.