کلون سازی و بررسی بیان ژن nlpD اسینتوباکتر بومانی در سلول های HDF انسان به روش RT-PCR

Abstract

سابقه و هدف: اسینتوباکتر بومانی یکی از باکتری­ های بسیار مقاوم در برابر انواع آنتی­ بیوتیک ­ها در جهان است. این باکتری عامل عفونت­ های بیمارستانی به صورت بومی یا همه­ گیر بوده و هنوز واکسن موثری علیه آن وجود ندارد. NlpD یکی از عوامل آنتی­ ژنی مهم است که سبب تحریک سیستم ایمنی میزبان می­ گردد. بنابراین، هدف از این تحقیق، کلون­سازی و بررسی بیان ژن nlpD باکتری اسینتوباکتر بومانی در سلول­ های HDF (Human dermal fibroblast) است. مواد و روش­ ها: در این تحقیق تجربی ژن nlpD از روی ژنوم اسینتوباکتر بومانی با استفاده از روش PCR تکثیر شد. سپس، ژن مذکور به­ ترتیب در ناقل ­های pTZ57R/T و pIRES2-EGFP کلون­سازی و ساب­کلون گردید. تایید صحت کلون­ سازی ژن با سه روش PCR، آنزیم ­های برش دهنده و تعیین توالی مورد ارزیابی قرار گرفت. سپس، ناقل نوترکیب نهایی pIRES2-EGFP-nlpD با کمک الکتروپوریشن به سلول­ های HDF منتقل گردید و بیان ژن هدف در این سلول­ ها با روش RT-PCR بررسی شد. نتایج: قطعه 831 جفت بازی مربوط به ژن nlpD اسینتوباکتر بومانی با موفقیت تکثیر شد. هم­ چنین، نتایج تحقیق نشان داد که سازواره نهایی pIRES2-EGFP-nlpD تشکیل گریده است. مشاهده باند 831 جفت بازی پس از انجام RT-PCR، در سلول­ های ترانسفورم شده نسبت به سلول­ های شاهد، موید بیان ژن nlpD در سلول­ هایHDF می­ باشد. نتیجه ­گیری: سازواره نهایی ساخته شده در این تحقیق توان بیان ژن nlpD اسینتوباکتر بومانی را در سلول­ های یوکاریوتی دارد. بیان موفق ژن هدف می­ تواند در راستای بررسی ایمنی­ زایی در حیوانات آزمایشگاهی به­ عنوان یک واکسن نوترکیب مدنظر قرار گیرد. هم­ چنین، سازواره pIRES2-EGFP-nlpD از پتانسیل لازم برای بررسی به ­عنوان واکسن ژنی در تحقیقات آینده برخوردار است.