طراحی، ترانسفورماسیون و تکثیر ایزوفرم نوترکیبVEGF111b در E. coli Top10 برای تولید داروی نوترکیب

Abstract

سابقه و هدف: سنتز پروتئین­ های نوترکیب با خاصیت مهار گیرنده­ های رشد در تومورهای سرطانی یکی از راه­ های جدید درمان سرطان است. هدف مطالعه حاضر طراحی و کلون ایزوفرم نوترکیبVEGF111b در وکتور pBudCE4.1 و بررسی سازگاری این سازه با باکتری E. coli Top10 جهت تولید داروی نوترکیب است.

مواد و روش ­ها: ایزوفرم جدید VEGF111b با استفاده از توالی­های موجود در بانک­های ژنی و نرم­افزار 7 oligoطراحی شده و توسط آنزیم­های BGLII و KpnI بریده شده و در پایین دست پروموتور EF-1 در وکتور pBudCE4.1 کلون شد. وکتور نوترکیب pBud.VEGF111b توسط روش کلرید کلسیم در باکتری E. coli Top10 ترانسفورم شد. جداسازی باکتری­ های نوترکیب در محیط LBA حاوی غلظت 3/0 و 5/0 درصد آنتی­بیوتیک زئوسین انجام شد. در مرحله آخر وکتور نوترکیب با استفاده از کیت استخراج DNA از ژل (Thermo K0513) استخراج شده و وجود قطعه نوترکیب VEGF111b توسط هضم آنزیمی و تعیین توالی تائید شد.

نتایج: الحاق قطعه 111b در جایگاه مورد نظر تائید شد. تمامی کلونی­ های E. coli Top10 مشاهده شده در محیط حاوی غلظت 0/5 درصد زئوسین حاوی قطعه نوترکیب VEGF111b بودند و در غلظت 0/3 درصد زئوسین، 61/9 درصد کلونی نوترکیب مشاهده شد. وجود توالیVEGF111b در باکتری ­های نوترکیب توسط هضم آنزیمی و تعیین توالی تائید شد.

نتیجه گیری: مطالعه حاضر گامی مهم در جهت تولید داروی نوترکیبVEGF111b و بررسی عملکرد ضد سرطانی این پروتئین است. وکتورpBudCE4.1 با دارا بودن 2 جایگاه کلونینگ و 8 جایگاه برش آنزیمی کاندید مناسبی برای کلونینگ و بیان پروتئین­ های نوترکیب در E. coli Top10 است.