کلونینگ ژن کدکننده آنتی‌ژن سطحی ویروس هپاتیت B در اشرشیاکولی

Abstract

زمینه و هدف: عفونت ویروس هپاتیت B در سراسر جهان آندمیک است. حدود 350 میلیون ناقل ویروس هپاتیت B در جهان وجود دارد. حدود یک میلیون نفر در سال به دنبال عفونت ویروس هپاتیت B تلف می‌شوند. متاسفانه دارویی که بتواند به درمان کامل هپاتیت B بیانجامد، وجود ندارد و تنها راه جهت کنترل اپیدمی‌ها، انجام واکسیناسیون می‌باشد. اندازه‌گیری مقدار DNA ویروسی برای شناسایی افرادی که دارای عفونت مزمن هستند، مورد استفاده قرار می‌گیرد، همچنین برای بررسی و پیش‌بینی سیر درمان بیماری و تاثیر داروهای ضد ویروسی در رژیم‌های درمانی کاربرد دارد. با معرفی Real-time PCR در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی، اندازه‌گیری کمی DNA ویروس در نمونه‌های بالینی به طور معنی‌داری توسعه پیدا کرده است. هدف از این مطالعه، کلونینگ و شناسایی ژن کدکننده آنتی‌ژن سطحی ویروس هپاتیت B به عنوان استاندارد خارجی است. روش بررسی: این تحقیق یک مطالعه توصیفی می‌باشد. برای تکثیر ژن S، ابتدا ژنوم ویروس از نمونه سرم که از نظر HbsAg(Hepatitis B surface Antigen) مثبت بود، استخراج شد. سپس با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، قطعه‌ای از ژن S با روش PCR(Polymerase chain reaction) تکثیر شد. برای کلونینگ ژن S از یک کلونینگ وکتور pTZ-57R(فرمنتاس) استفاده گردید. پس از خالص‌سازی، محصول PCR به داخل وکتور پلاسمیدی کلون شد و به داخل سلول مستعد E.Coli سویه TG1، ترانسفورم شد. باکتری حاوی پلاسمید نوترکیب با روشهای مختلف از قبیل مقاومت به آنتی‌بیوتیک، PCR، برش با آنزیم‌های اختصاصی و در نهایت تعیین توالی، مورد بررسی قرار گرفت. برای آنالیز آماری، از آزمون t و محاسبه میانگین تعداد کلنی‌های شمارش شده بر روی پلیت‌های حاوی آنتی‌بیوتیک و بدون آن، استفاده گردید. یافته‌ها: پس از استخراج DNA ویروسی با استفاده از آغازگرهای اختصاصی، ژن S با روش PCR تکثیر شد و قطعه‌ای شامل 175 جفت باز حاصل گردید، سپس ژن S با استفاده از پلاسمید pTZ57R کلون گردید. پلاسمید نوترکیب استخراج شد و با روش PCR و برش آنزیمی، مورد تایید قرار گرفت. برای تایید نهایی، پلاسمید نوترکیب تعیین توالی شد. نتیجه‌گیری: نتایج حاصل از این مطالعه نشان می‌دهد که قطعه 175 جفت‌بازی ژن S در پلاسمید pTZ57R کلون گردیده است که می‌توان از آن، جهت تهیه استاندارد Real-time PCR یا کنترل مثبت در آزمایش‌ها استفاده نمود.