طراحی و ساخت کانسترکت نوترکیب واجد ژن اینترفرون بتای جهش یافته در ناحیه‌ کزاک (Kozak) به منظور تشدید ترجمه

Abstract

زمینه و هدف: اینترفرون بتا یکی از مهمترین اعضای گروه I اینترفرون‌ها بوده و به عنوان داروی اصلی در بسیاری از بیماری‌ها از جمله بیماری مالتیپل اسکلروزیس استفاده می‌شود. پروتئین اینترفرون بتا واجد نیمه‌ی عمر کمی بوده و لذا بیماران به دریافت مکرر دارو نیازمند می‌باشند. با توجه به اهمیت دارویی پروتئین اینترفرون بتا، امروزه تلاش‌های گسترده‌ای در جهت بهبود سطح ترجمه و افزایش تولید آن صورت پذیرفته است. چندین عامل مهم می‌تواند بر روی میزان بیان پروتئین در سلول تأثیر گذار باشند که توالی مناسب احاطه کننده کدون آغاز (توالی کزاک) از جمله‌ی آن موارد می‌باشد.

روش کار: پرایمرهای اختصاصی جهت ایجاد جهش هدفمند در توالی کزاک با استفاده از روش SOEing PCR (Splicing by overlap extension / Splicing by overhang extension (SOE) PCR) طراحی و PCR انجام شد. به منظور ایجاد جهش مورد نظر در ژن اینترفرون بتا سه واکنش PCR انجام پذیرفت. محصول نهایی جهش یافته و پلاسمید pSVM، برش داده شده و متعاقبا اتصال بین محصولات برش داده شده توسط لیگاز انجام گرفت. پس از ترانسفورماسیون با استفاده از مخلوط لایگیشن، استخراج پلاسمید صورت گرفت. پس از تولید کانسترکت و تأیید با استفاده از روش‌های هضم آنزیمی و PCR کانسترکت نوترکیب به رده‌ی سلولی CHO با استفاده از کیت لیپوفکتامین ترانسفکت گردید.

یافته‌ها: در تحقیق حاضر با استفاده از روش‌های مهندسی ژنتیک کانسترکت نوترکیب اینترفرون بتا تولید گردید. در این کانسترکت با استفاده از روش SOEing PCR و ایجاد جهش‌های هدفمند در ناحیه‌ی توالی کزاک، توالی مذکور به حالت ثابت نزدیک گردید. کلنی‌های سفید رنگ بر روی محیط کشت پس از ترانسفورماسیون مشاهده گردید. استخراج پلاسمید از کلنی‌ها انجام گرفته و صحت کانسترکت نوترکیب با استفاده از هضم آنزیم و همچنین PCR تأیید گردید. طول قطعه‌ی ایجاد شده پس از هضم آنزیمی صحت کلون نمودن ژن نوترکیب اینترفرون بتا را تأیید نمود. پس از تأیید فرایند کلونینگ، سلول‌های CHO کشت داده شده و ترانسفکشن پلاسمید نوترکیب به رده‌ی سلولی CHO صورت گرفت.

نتیجه‌گیری: جهش هدفمند در توالی کزاک ژن اینترفرون بتا صورت گرفت. جهش مورد نظر بر روی توالی کزاک می‌تواند سبب بهبود و افزایش میزان ترجمه پروتئین اینترفرون بتا گردد. در مراحل بعدی میزان تأثیر جهش در روند تولید پروتئین با استفاده از روش‌ ELISAبررسی خواهد شد.