طراحی و ایجاد موتاسیون در ژن wbk A بروسلا آبورتوس S19 به روش Overlap Extension PCR

Abstract

زمینه مطالعه: ایجاد موتاسیون در جایگاه اختصاصی می‌تواند یکی از روش‌های کارآمد جهت بررسی ویژگی و خواص تنظیمی ژن‌های گوناگون باشد. ﺑﺮوﺳﻠﻮز از ﻣﻬﻢ ﺗﺮﯾﻦ ﺑﯿﻤﺎریهای ﻋﻔﻮﻧﯽ ﻣﺸﺘﺮک ﺑﯿﻦ اﻧﺴﺎن و دام اﺳﺖ ﻛﻪ ﻣﻨﺠﺮ ﺑﻪ بروز ﺿﺮرهاى اﻗﺘﺼﺎدى ﻓﺮاواﻧﻰ ﻣﻰ ﺷﻮد. ﺑﻨﺎﺑﺮاﯾﻦ ﺷﻨﺎﺳﺎﯾﯽ ﻋﻮاﻣﻞ پاتوژن و اﯾﻤﻨﯽ زا در جنس ﺑﺮوﺳﻼ ﺑﻪ ﻋﻨﻮان راهگشای ﺟﻬﺖ ﮐﻨﺘﺮل اﯾﻦ ﻣﻌﻀﻞ ﺑﻬﺪاﺷﺘﯽ ﻣﻄﺮح ﻣﯽ‌ﺑﺎﺷﺪ. هدف: با توجه به اهمیت جهش هدفدار در شناسایی ساختار ژنوم و وجود روش‌های متعدد جهت دست یابی به این هدف، روش Overlap Extension PCR به عنوان یک تکنیک اصلاح شده جهت حذف و جایگزینی ژن هدف معرفی می‌شود. روش کار: جهت انجام این تحقیق، با انجام دو مرحله PCR با استفاده از پرایمرهای اختصاصی، قطعات بالادست و پایین دست ژن هدف از ژنوم باکتری و کاست مقاومت آنتی بیوتیکی از پلاسمیدa(+)رpET28، تکثیر یافته و به یکدیگر اتصال یافتند. قطعه حاصله با استفاده از آنزیم‌های محدودالاثر که توالی آنها در انتهای ´5 پرایمرهای خارجی قرار داده شده است، در جایگاه اختصاصی از پلاسمید (-) pBluescriptIISKهمسانه سازی شده و پس از حصول اطمینان از عدم ایجاد جهش خودبخودی در حین مراحل PCR، با استفاده از روش الکتروپوریشن به داخل ژنوم <em>بروسلا آبورتوس</em> انتقال یافت. نتایج: همسانه سازی محصول PCR اتصالی که بدون بروز تغییر در توالی نوکلئوتیدی حاصل شده بود، داخل پلاسمید (-) pBluescriptIISK انجام شد و پس از انتقال الکتریکی پلاسمید به ژنوم <em>بروسلا آبورتوس</em>، طی عمل ریکامبینیشن باعث جهش در ژن مورد نظر گردید. نتیجه گیری نهایی: نتایج این مطالعه نشان می‌دهد که Overlap Extension PCR یک تکنیک بهینه و اصلاح شده به منظور ایجاد جهش در ساختار ژنوم باکتری بوده و به راحتی می‌تواند در خانواده بروسلا استفاده گردد.