بهینه سازی شرایط بیان آنزیم کیتیناز42 کایمری در میزبان پروکاریوتی و مقایسه فعالیت آن با آنزیم کیتیناز42

Abstract

آنزیم¬های کایمری از جمله پروتئین¬های مهندسی شده می¬باشند که از تغییر در ساختار آنزیم¬ها بدست می¬آیند. آنزیم¬های کیتینازی بدلیل توانایی در تجزیه ترکیبات کیتینی، در تولید پروتوپلاست قارچی، تبدیل زیستی shellfish waste به بخش‌های تک جزئی، تولید الیگوساکاریدها و کنترل قارچ¬های بیماریزا حائز اهمیت می-باشند. در این تحقیق پس از تکثیر ناحیه (chitin binding domain) ChBD کیتینازB باکتری Serratia marcescens و cDNA ژن کیتیناز42 قارچ Trichoderma atroviride (فاقد ChBD) با استفاده از آغازگرهای همپوشان، کیتینازکایمری با استفاده از روش SOEing PCR تکثیر و در ناقل بیانی همسانه¬سازی شد. سازه بیانی نوترکیب حاصل ابتدا به میزبان بیانی پروکاریوتی منتقل و سپس بهینه سازی بیان پروتئین مورد نظر در این میزبان، با استفاده از روش تاگوچی انجام شد. اثر عواملی مانند غلظت IPTG، دمای انکوباسیون و مدت زمان انکوباسیون پس از القاء، بر بیان کیتینازکایمری بررسی شد. با توجه به آرایه¬های متعامد تاگوچی در 3 عامل و 4 سطح، 16 آزمایش طراحی شد. پس از انجام این آزمایش ها پروتئین تام از سلول استخراج و در ژل SDS-PAGE مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از SDS-PAGE با استفاده از نرم افزار Total lab کمی شده و سپس با استفاده از برنامه Qualitek-4 تجزیه وتحلیل شد. نتایج حاصل نشان داد که در بین عوامل مختلف، غلظت IPTG بیشترین اثر را بر بیان پروتئین کیتینازکایمری دارد. بهترین شرایط بیان برای پروتئین کیتینازکایمری به ترتیب IPTG با غلظت یک میلی¬مولار، دمای 28 درجه سانتیگراد به مدت 16 ساعت بدست آمد.