ایجاد توتون تراریخت تولیدکننده لاکاز قارچی با استفاده از یک پروموتر دارای بیان ریشه-ویژه

Abstract

لاکازها گروهی از گلیکوپروتئین‏ها با ویژگی پلیفنلاکسیدازی هستند که می‌توانند ترکیبات گوناگونی را اکسید نمایند. این گروه آنزیمی در گیاهان، قارچ‌ها، حشرات و باکتری‌ها بیان می‌شوند و دارای نقش‌های مهمی در فعالیت‌های زیستی و کاربردهای گوناگونی در صنایع غذایی، دارویی، نساجی و حتی نظامی می‌باشند. با توجه به ساختار این آنزیم و این‌که تشکیلات بیان پروتئین در گیاهان قادر به تولید کامل پروتئین‌ها ازجمله گلیکوپروتئین‏ها می‌باشند به جهت کاربرد در پالایش زیستی، سازه‌ای طراحی گردید که لاکاز II قارچی تحت کنترل پیشرانه باکتریایی ویژه بیان در ریشه مانوپین سنتاز و تشدیدکننده ترجمه Tobacco Etch Virus در گیاه توتون بیان شود. افزودن سیگنال پپتید اندوکیتیناز اسیدی Q توتون به ابتدای آنزیم باعث ترشح آن به فضای آپوپلاستی می‌شود. با استفاده از واکنش زنجیره‌ای پلیمراز، تراریختی گیاهان توتون توسط ژن لاکاز به‌وسیله آگروباکتریوم تأیید گردید. نتایج نیمهکمی بیان ترانسکریپتومیک لاکاز در ریشه و برگ تراریخت‏های مفروض نشانگر بیان متمایز آن در ریشه و برگ بود که ناشی از کارکرد متمایز پیشرانه باکتریایی مانوپین سنتاز می‌باشد. نتیجه وسترن بلاتینگ تولید پروتئین بالغ در ریشه را تأیید کرد. وجود این پروتئین به‌صورت تک سایز نشانه عملکرد صحیح سیگنال پپتید و ترشح آن به فضای آپوپلاستی در ریشه توتون می‌باشد. با توجه به کاربرد این گیاهان جهت استخراج آنزیم یا پالایش زیستی می‌توان تراریخت‏های موردنظر را بر اساس میزان پروتئین و فعالیت آنزیمی غربالگری و گزینش نمود.