کلونینگ و بیان ژن رمزگذار آنزیم تجزیه‌کننده ترکیبات آلی فسفره (opd) در باکتری Escherichia coli

Abstract

کاربرد گستردۀ ترکیب‌های آلی فسفرۀ منجر به بروز اثر زیان‌آور زیست‌محیطی بسیاری شده است. استفاده از میکروارگانیسم­ها در پالایش و اندازه‌گیری این ترکیب‌های ناگوار به‌عنوان یک رویکرد دوستدار محیط­زیست و مناسب شناخته شده است. آنزیم ارگانوفسفروس هیدرولاز از آنزیم‌های هیدرولیزکنندۀ فسفوتری­استری است که در برخی میکروارگانیسم­های خاک به‌ویژه <em>Flavobacterium </em>sp.شناسایی شده و قادر به هیدرولیز تعدادی از ترکیب‌های فسفرۀ آلی است. در این پژوهش بهینه‌سازی کدون‌های توالی رمزگذار این پروتئین برای بیان در باکتری <em>Escherichia coli</em> انجام شد و سپس همراه با پروموتر <em>lac</em>، در وکتور پروموتر-پروب pTH1705 به‌صورت ادغام الگوبرداری کلون شد و ترانسفورماسیون‌ در دو سویۀ‌ باکتری <em>E. coli</em> انجام گرفت. محیط کشت معدنی M9 حاوی غلظت 10و 50 میلی­گرم در لیتر دیازینون، برای سنجش عملکرد باکتری تراریخت بیان‌کنندۀ ژن <em>opd</em> (به‌صورت <em>in trans</em>) استفاده شد. بررسی منحنی رشد استرین <em>E. coli</em> V103 نشان داد، رشد باکتری در غلظت 50 میلی­گرم در لیتر دیازینون تا حد زیادی تحت تأثیر (وجود آفت­کش) قرار می­گیرد درحالی‌که در غلظت 10 میلی‌گرم در لیتر دیازینون این تأثیر کمتر است. نتایج حاصل از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا به‌عنوان یک روش استاندارد نشان داد، غلظت دیازینون در محیط کشت باکتری، در چهار استرین V100، V101، V102 و V103 پس از 24 ساعت از 10 میلی­گرم در لیتر به ترتیب به 38/6، 19/7، 09/7 و 74/5 میلی­گرم در لیتر کاهش یافت. این نتایج بیانگر انتقال موفق و نیز بیان ژن مورد نظر در باکتری است و این باکتری نوترکیب مهندسی‌شده توانایی تجزیۀ ترکیب‌های فسفره را دارد.