طراحی و ساخت ناقل نوترکیب CRISPR حاوی ژن LRRK2 بیماری پارکینسون

Abstract

<strong>هدف:</strong> هدف از این مطالعه تخریب ژن کیناز غنی از لوسین شماره 2 LRRK2))، مهم‌ترین ژن درگیر در بیماری پارکینسون با استفاده از تکنولوژی CRISPR-Cas بود. <strong>مواد و روش‏ها:</strong> مراحل همسانه سازی قطعات راهنما در این پژوهش با استفاده از کیت کلونینگ gRNAسیستم کریسپر (شماره کاتالوگ C8324K شرکت زاور زیست آزما) انجام شد. ابتدا 4 الیگونوکلئوتید برای توالی اگزون 41 ژن LRRK2 توسط نرم افزارساختRNA راهنمای CRISPR با عنوان CHOCHOPطراحی شدند. این دو RNA) gRNAsراهنما) در دو طرف اگزون فوق در نظر گرفته شدند. مولکول‌های دو رشته‏ای DNA بر اساس دستورالعمل استاندارد در آزمایشگاه ساخته شدند. قطعات دو رشته ای 20 جفت بازی راهنما که برای تشکیل کمپلکس Cas9-gRNA استفاده می‌شوند، با استفاده از آنزیم DNA لیگاز به وکتور بیانی یوکاریوتی کریسپر Px459 متصل و پلاسمیدهای نوترکیب به درون باکتری<em> E.Coli DH5a</em>میزبان با روش شوک حرارتی منتقل شدند. نتایج آزمایشها به‏وسیله روش‏های RCP و تعیین ردیف AND ارزیابی شدند. <strong>نتایج:</strong> آزمایشهای چندگانه PCR با استفاده از پلاسمیدهای نوترکیب به‏عنوان AND الگو و توالی‏یابی AND، همسانه سازی قطعه‏های کوچک راهنما در پلاسمید بیانی کریسپر را نشان داد. <strong>نتیجه‏گیری:</strong> نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد، سیستم CRISPR می‌تواند به‏عنوان یک ابزار قوی فراگیر برای ویرایش و تنظیم بسیاری از ژن‏‌های موثر در بیماری‏ها از جمله بیماری پارکینسون استفاده شود.