ساخت و تکثیر cDNA از mRNA ژن رمز گردان آنزیم P5CS گیاه Arabidopsis thaliana

Abstract

گیاهان وقتی در معرض خشکی و شوری قرار می گیرند با تنش اسمزی مواجه می شوند که برای مقابله با تنش اسمزی ایجاد شده تجمع اسمولیتهایی همچون پرولین ، گلیسین بتانین و یا سایر ترکیبات مشابه را افزایش می دهند.در مسیر بیوسنتز این اسمولیتها آنزیمهایی دخالت دارند که بعضی از آنها کلیدی به حساب می‌آیند و با تغییر در تظاهر ژنهایی که این آنزیمها را کد می کنند می توان فراوردة نهایی که اسمولیت مورد نظر می‍‍باشد را افزایش داد. این تحقیق بر روی آنزیم دلتا ـ1ـ پرولین ـ5ـ کربوکسیلات سنتتاز (P5CS ) که یکی از آنزیم های کلیدی در مسیر بیوسنتز پرولین می‍باشد ، انجام شد . ابتدا اقدام به ساخت cDNA از روی mRNA حاصل از گیاه آرابیدوپسیس تالیانا (Arabidopsis thaliana) گردید . برای اینکار RNA کل از برگهای گیاه آرابیدوپسیس تالیانا (Arabidopsis thaliana )، که در معرض تنش شوری قرار گرفته بود ، استخراج گردید و سپس با استفاده از آنزیم رونویسی معکوس اقدام به ساخت DNA مکمل شد و کل mRNA به cDNA تبدیل گردید و با دو جفت آغازگر اختصاصی به طولهای 27 و 35 نوکلئوتید ، و به کمک دستگاه ترموسایکلر، cDNA مربوط به آنزیم P5CS دو رشته ای گردید و تکثیر شد.برای جفت پرایمر به ترتیب در انتهای َ5 ، مکان برشی برای آنزیم های EcoRI و BamHI در نظر گرفته شد تا در همسانه سازی cDNA تکثیر شده مشکلی وجود نداشته باشد . سپس با استفاده از پروب صحت انجام کار به تأیید رسید.