کلونینگ ژن هورمون رشد (GH) فیل ماهی (Huso huso) در سازه های لنتی ویروسی و غیر ویروسی و بررسی بیان ژن در سلولهای بنیادی جنینی انسانی

Abstract

یکی از مهمترین کاربردهای مهندسی ژنتیک در تحقیقات آبزی پروری، افزایش میزان رشد ماهیان پرورشی از طریق انتقال ترنس ژنهای هورمون رشد به آنهاست. اما پیش از هر گونه تلاش در جهت انتقال ژن، ساخت و سنتز این ترنس ژنهای مطلوب الزامی است. از این رو در این تحقیق، ابتدا لنتی ویروس های نوترکیب حاوی ژن هورمون رشد (GH)فیل ماهی Huso huso به عنوان یکی از مهمترین گونه های ماهیان خاویاری تولید شد، سپس از آنها برای انتقال سازه ژنی به سلولهای هدف، به منظور تولید پروتئین نوترکیب هورمون رشد و آنالیزهای بیانی بهره برداری شد. در این مطالعه، cDNA هورمون رشد فیل ماهی استروژن که با استفاده از RNA استخراج شده از غده هیپوفیز سنتز شده است، با روش واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) تکثیر شد، سپس این قطعه ژن پس از کلونینگ در وکتور پلاسمیدی pTZ57R/T بر اساس جایگاه های آنزیمی مشخص برش داده شده و نهایتاً به بدنه ناقل لنتی ویروسی pNL-EGFP/CMV-WPRE ساب کلون گردید. طی ترانسفکشن همزمان ناقل نهایی (ناقل انتقال pLV-GH-IRES-EGFP) به همراه دو ناقل کمکی (ناقل بسته بندی ویروسpCD/NL- BH*ΔΔΔ و ناقل غشائی LTR-G) با لیپوفکتامین، کمپلکس DNA- لیپد تشکیل و به درون رده سلولی بنیادی جنینی انسانیHEK-293T منتقل شده و لنتی ویروس های نوترکیب حاوی سازه ژنی مورد نظر تولید و به روش RT- PCR تأیید شدند. از آنجاکه در ساختار این وکتور ژن نشانگر EGFP، بواسطه قطعه IRES در فرودست ژن GH قرار داده شده بود،