بیان نوترکیب بخش C-ترمینال پروتئین Rif1 و محلول سازی آن با سارکوزیل

Abstract

ژنوم یوکاریوتی حاوی چندین محل شروع همانندسازی می¬باشد. بررسی¬ها نشان می¬دهد که روند و ترتیب فعال شدن این منشأها با نظم خاصی صورت می¬گیرد که این فرآیند منظم را اصطلاحاَ زمانبندی همانندسازی (Replication timing) می-گویند. مطالعات اخیر نشان می¬دهد که فاکتورهای زیادی در تنظیم زمانبندی فرآیند همانندسازی نقش دارند. یکی از مهمترین این فاکتورها پروتئین متصل¬شونده به Rap1 (Rif1)، می¬باشد که نقش اساسی را در تنظیم برنامه زمانبندی همانندسازی در مخمر و یوکاریوت¬های پیشرفته¬تر ایفا می¬کند. قسمت عمده ساختار این پروتئین به صورت نامنظم بوده و این ویژگی¬ها مانع از بیان Rif1 به صورت پایدار شده و مطالعه بر روی آن را دشوار می¬کند. هدف از مطالعه کنونی بیان نوترکیب دمین C-ترمینال پروتئین Rif1 موشی (muRif1-CTD) به صورت محلول می¬باشد. بدین منظور ژن muRif1-CTD از سازه یوکاریوتی حاوی ژن کامل Rif1 به کمک PCR استخراج و در وکتور بیانی pPAL7 که حاوی برچسب Profinity eXact بود، قرار گرفت. محلول¬سازی پروتئین با استفاده از دترجنت¬های مختلف و در مرحله بعد حذف دترجنت با استفاده از دیالیز صورت پذیرفت. به منظور اطمینان از اینکه پروتئین محلول شده دارای فعالیت است آنالیز برهمکنش پروتئین Rif1 با ساختار G4 (که قبلا در رابطه با اتصال به Rif1 معرفی شده بود) با روش ژل شیفت مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این بررسی نشان داد که استفاده از دترجنت می¬تواند برای محلول سازی پروتئین Rif1 بدون اثرگذاری بر مراحل خالص¬سازی آن مورد استفاده قرار گیرد. لیکن در مورد این پروتئین در صورت فقدان کامل دترجنت، این پروتئین به صورت محلول نخواهد بود.