بیان، تخلیص و تعیین خصوصیات دومین متصل‌شونده به IP3 نوع 2 انسانی

Abstract

اهداف: IP۳ یک مولکول کلیدی تنظیم‌کننده در مسیر انتقال پیام است و با اتصال به گیرنده‌های درون‌سلولی IP۳R روی سطح ذخایر کلسیم داخل‌سلولی باعث آزادسازی کلسیم به درون سیتوپلاسم می‌شود. هدف این پژوهش، بیان، تخلیص و تعیین خصوصیات دومین متصل‌شونده به IP۳ )IP۳BD:۱-۶۰۴ aa( نوع ۲ انسانی بود. مواد و روش‌ها: در پژوهش تجربی حاضر، پلاسمید pET-۲۸a حامل ژن IP۳BD با روش شیمیایی به داخل باکتری‌های بیانی E.coli سویه BL۲۱) DE۳( منتقل شد. برای بهینه‌سازی بیان در سیستم باکتریایی، بیان در شرایط مختلف مورد بررسی قرار گرفت و دماهای بیان مختلف از جمله ۱۶، ۱۸، ۲۰ و C۲۴º، زمان‌های مختلف بعد از القا، نوع القاکننده و غلظت‌های مختلف آن بررسی شد. باکتری‌های القاشده براساس شوک حرارتی از طریق کروماتوگرافی تمایلی ستون نیکل- سفارز تخلیص و میزان خلوص پروتئین از طریق SDS-PAGE بررسی شد. نشر فلورسانس دومین متصل‌شونده به IP۳ در حضور و عدم حضور لیگاند IP۳ در طول موج ۲۹۵نانومتر اندازه‌گیری شد. یافته‌ها: پروتئین در محیط‌های LB و TB و ۲xYT بیان قابل توجهی نداشت و در زمان‌های مختلف تغییری در آن مشاهده نشد. بیان پروتئین باکتری در دمای C۲۰º براساس شوک حرارتی C۴۲º نسبت به تمام حالات بیشتر بود. تخلیص باکتری‌های القاشده براساس شوک حرارتی به‌سختی تکرار می‌شد و نمونه‌های خالص‌شده نیز غلظت بالایی نداشتند. نشر فلورسانس پروتئین در حضور لیگاند IP۳ کاهش یافت. نتیجه‌گیری: بیان باکتریایی دومین متصل‌شونده به IP۳ از گیرنده نوع ۲ گونه انسانی ضعیف است، ولی با القای شوک C۴۲º بیان پروتئین تا حدود نسبتاً زیادی افزایش می‌یابد.