کلون‌کردن DNA و بیان پروتئین آلفا- سینوکلئین در باکتری اشریشیاکلی

Abstract

اهداف: شناخت ساختار و عملکرد پروتئین آلفا- سینوکلئین می‌تواند زمینه‌ساز توسعه روش‌های درمانی مناسب علیه بیماری پارکینسون باشد. هدف پژوهش حاضر، کلون‌کردن DNA و بیان پروتئین آلفا- سینوکلئین در باکتری اشریشیاکلی بود. مواد و روش‌ها: در پژوهش تجربی حاضر، توالی کدکننده آلفا- سینوکلئین موجود در پلازمید نوترکیب pRK۱۷۲، به کمک روش PCR و با استفاده از پرایمرهای مناسب تکثیر شد. DNA سنتزشده توسط آنزیم‌های محدودگر SalI وHindIII بریده و در حامل‌ pET۲۸a کلون و پلازمید نوترکیب به روش کلسیم کلراید به سویه بیانی باکتری اشریشیاکلی (BL۲۱) منتقل شد. بیان آلفا-سینوکلئین توسط محلول IPTG القا و بیان پروتئین نوترکیب با روش الکتروفورز SDS-PAGE ارزیابی شد. ردیف‌سازی توالی‌ها به کمک الگوریتم ClustalW با برنامه BioEdit ۵.۰.۹ صورت پذیرفت. یافته‌ها: در محصولات واکنش‌های برش آنزیمی DNA و پلازمید pET۲۸a با آنزیم‌های محدودگر، اندازه قطعات، نشان‌دهنده صحت واکنش‌های آنزیمی بود. DNA تکثیرشده و پلازمید pET۲۸a مورد استفاده به‌ترتیب با طول‌های ۴۰۷ و ۵۳۶۹ نوکلئوتید بودند. ترجمه حاصل از توالی قطعه کلون‌شده، تشابه ۱۰۰% با پروتئین آلفا- سینوکلئین انسانی را نشان داد. در بیان پروتئین نوترکیب در قیاس با نمونه‌های شاهد منفی، افزودن IPTG موجب افزایش بیان پروتئین آلفا- سینوکلئین در تمامی نمونه‌ها به‌ویژه ۲ ساعت پس از القا شد. بیشتر آلفا- سینوکلئین بیان‌شده از پلازمید pET۲۸a-alpha-Synuclein به‌صورت اجسام گنجانده در باکتری تجمع یافتند. نتیجه‌گیری: پروتئین آلفا- سینوکلئین در پلازمید pET۲۸a کلون و تشکیل اجسام گنجانده توسط آلفا- سینوکلئین به‌هنگام بیان از سامانه pET۲۸a-alpha-Synuclein تایید می‌شود و راه را بر تولید این پروتئین در مقیاس بالا هموار می‌سازد.