کلونینگ، بیان و تخلیص اندونوکلئاز CEL I نوترکیب در رده سلولی HEK293T

Abstract

اندونوکلئاز CEL I، آنزیمی از خانواده S۱ اندونوکلئازها است. این آنزیم، با اختصاصیت بالا، توانایی شناسایی انواع جهش‌ها و جایگزینی بازها در مولکول DNA را دارد که این امر اهمیت آن را در قالب محصولات تجاری به‌منظور مصارف تحقیقاتی و آزمایشگاه‌های بالینی دوچندان می‌کند. اگرچه این آنزیم در گیاه کرفس یافت می‌شود اما به‌دلیل زمان‌بربودن فرآیند استخراج و همچنین بازدهی کم محصول نهایی، استخراج آن مقرون‌به‌صرفه نیست. علاوه بر این، با توجه به لزوم اعمال تغییرات پس از ترجمه برای دست‌یابی به ساختار فعال نهایی، تاکنون گزارشی مبنی بر بیان فرم فعال این آنزیم در میزبان‌های باکتریایی مشاهده نشده است. بنابراین یکی از منابع تولید فرم فعال این آنزیم، کلون و بیان آن در میزبان‌های یوکاریوتی از جمله مخمر و رده‌های سلولی پستانداران است. در این مطالعه، توالی ژن به‌منظور بیان در میزبان یوکاریوتی HEK۲۹۳T بهینه‌‎سازی و سنتز شد. سپس توسط هضم دوگانه با آنزیم‌های KpnI و XhoI در وکتور بیانی pBudCE۴.۱ ساب‌کلون شد. سازه بیانی مورد نظر توسط لیپوفکتامین به رده سلولی HEK۲۹۳T ترانسفکت و بیان پروتئین نوترکیب از طریق روش‌های متعددی از جمله SDS-PAGE، الایزا، واکنش نسخه‌برداری معکوس و وسترن‌بلات تایید شد. آنالیز داده‌های SDS-PAGE و وسترن‌بلات وزن مولکولی در حدود ۳۰کیلو دالتون را تایید کرد. تخلیص با ستون حاوی رزین Ni-NTA انجام و مقدار پروتئین در حدود ۰/۲میلی‌گرم بر میلی‌لیتر تعیین غلظت شد. درنهایت فعالیت اندونوکلئازی آنزیم، روی DNA هترودوپلکس حاصل از محصول PCR ژن جهش‌یافته و وحشی بررسی شد. نتایج نشان داد که بیان این پروتئین در میزبان HEK۲۹۳T فعالیت مناسبی دارد.