طراحی و ساخت وکتور بیانی اختصاصی کراتینوسیت های اپیدرمو بررسی بیان فاکتورIX انسانی به عنوان مدل

Abstract

چکیده سابقه و هدف کراتینوسیت یک مدل مناسب برای بیان ژن به صورت ex vivo برای رهاسازی سیستمیک پروتئین است. با توجه به این نکته عناصر کنترلی اختصاصی کراتینوسیت‌ها، گزینه‌های مناسبی برای بیان ژن با واسطه کراتینوسیت‌ها هستند. در پژوهش حاضر یک وکتور برای بیان اختصاصی پروتئین‌های نوترکیب در کراتینوسیت‌های اپیدرم با استفاده از پروموتر ژن کراتین‌ـ‌ 14 انسانی طراحی گردید. توانایی پلاسمید ساخته‌شده به‌وسیله بیان cDNA فاکتور انعقادی IX انسان ی در کراتینوسیت‌های اولیه انسانی نشان داده‌شد. مواد وروش ها مطالعه انجام شده از نوع تجربی بود. با قرار گرفتن یک قطعه حاوی پروموتر ژن کراتین ـ 14 انسانی به جای پروموتر سیتومگالوویروس ( CMV ) در پلاسمید pcDNA3 ، پلاسمید بیانی phPK14H ساخته شد. در مرحله بعد cDNA فاکتور IX انسانی که از کتابخانه cDNA کبدی جدا شده بود، وارد پلاسمید بیانی شد و پلاسمید pK14hFIX ساخته شد و برای ترانسفکشن کراتینوسیت‌ها مورد استفاده قرار گرفت. کراتینوسیت‌های انسانی از پوست ختنه نوزادان جدا و با استفاده از محیط کشت عاری از سرم مخصوص کراتینوسیت‌ها کشت داده شدند. سلول‌های مزبور با پلاسمید نوترکیب جدید ساخته شده ( pK14hFIX ) با استفاده از فیوجین-6 ترانسفکت شدند. حدود 72 ساعت پس از ترانسفکشن، محیط کشت به‌دست آمده از سلول‌های ترانسفکت شده برای بررسی بیان فاکتور IX جمع آوری و سلول‌ها به محیط کشت انتخابی حاوی جنیتیسین منتقل شدند. ادامه کشت سلول‌های مزبور در محیط انتخابی منجر به پدیدار شدن 9 کلنی شد که در ادامه هر یک به صورت جداگانه کشت داده شده و مورد مطالعه قرار گرفتند. بیان cDNA فاکتور IX با استفاده از آزمون انعقادی یک مرحله‌ای بر روی محیط‌های کشت و هم‌چنین انجام RT-PCR بر روی سلول‌های کراتینوسیت ترانسفکت مورد مطالعه قرار گرفت. یافته‌ها زمان‌های انعقاد به دست آمده از محیط‌های کشت سری‌های مختلف ترانسفکشن با کنترل‌های منفی مقایسه شد. فعالیت انعقادی فاکتور IX نوترکیب در محیط کشت کراتینوسیت‌های ترانسفکت شده قبل از تیمار جنیتیسین وپس از انتخاب کلنی‌ها با جنیتیسین نشان داده شد. بیان cDNA فاکتور IX در سلول‌های ترانسفکت شده هم‌چنین با انجام RT-PCR تایید شد. نتیجه‌گیری نتایج اولیه ما نظریه‌ای که کراتینوسیت‌های انسانی قادر به تولید فاکتور IX فعال تحت کنترل پروموتر کراتین‌ـ14هستند را تایید می‌کند. علاوه بر این پلاسمید ساخته شده حاصل از این تحقیق ابزار مناسبی برای بررسی بیان پروتئین‌هایی که از اهمیت درمانی برخوردارند را در کراتینوسیت‌ها برای مطالعات مختلف بیوشیمیایی و سلولی فراهم ساخته است. کلمات کلیدی: فاکتور IX ، کراتینوسیت، کراتین ـ 14، ژن درمانی سوماتیک