تشخیص هیستیدین اساسی در عمل کاتالیتیکی آنزیم فسفاتیدات فسفوهیدرولاز غشایی کبد موش صحرایی نر

Abstract

سابقه و هدف: آنزیم فسفاتیدات فسفوهیدرولاز (PAP) باعث تبدیل اسید فسفاتیدیک به دی‌آسیل گلیسرول و فسفات معدنی (Pi) می شود. دو فرم مختلف از آنزیم PAP در سلولهای کبدی موش صحرایی گزارش شده است، یکی PAP1 که در متابولیسم فسفولیپیدها و گلیسرولیپیدها و دیگری PAP2که در پدیده Signal transduction نقش دارد. PAP2 در موش صحرایی دارای دو ایزوفرم PAP2a و PAP2b می باشد. در این مطالعه وجود هیستیدین اساسی در آنزیم PAP2b مورد بررسی قرار گرفت.مواد و روش ها: با استفاده از n- اکتیل گلوکوزید، غشای سلول های کبدی موش صحرایی حل گردید و PAP2b طی چندین مرحله ی کروماتوگرافی تخلیص گردید. ثابت‌های کینتیکی بــر اساس مدل کینتیک رقت سطحی تعیین گردیدند. جهت تعیین خلوص، تعداد و وزن زیرواحدهای آنزیمی از روش الکتروفورز ناپیوسته در حضور SDS با ژل پلی اکریل آمید 10 درصد استفاده گردید. تعداد مول هیستیدین موجود در یک مول آنزیم با استفاده از مشتق –N کربتوکسی هیستیدین محاسبه شد.نتایج: PAP2b تخلیص شده فعالیت ویژه‌ای معادل mU/mg protein7350 داشت. الکتروفورز PAP2b تخلیص شده در حضور SDS یک نوار با وزن مولکولی 8/33 کیلودالتون نشان داد. مطالعات غیرفعال سازی آنزیم به وسیله معرف دی‌اتیل ‌پیرو کربنات شواهدی بر ضرورت وجود هیستیدین اساسی برای فعالیت آنزیم مهیا کرد. تعداد مول هیستیدین تعدیل شده به ازای هر مول آنزیم 6 عدد بود. نتیجه گیری: مهار آنزیم توسط دی‌اتیل پیرو کربنات نسبت به اسید فسفاتیدیک رقابتی بود و نشان از حضور هیستیدین در مکان فعال آنزیم داشت. احتمالا واکنش کاتالیتیکی PAP2b نیز می‌بایستی همانند سایر اعضای خانواده‌اش از طریق تشکیل واسطه ی فسفوهیستیدنی انجام گیرد.