معرفی روش مولکولی PCR آشیانه ای (Nested RT-PCR) اصلاح شده جدید جهت تشخیص سریع بیماری نکروز عصبی ویروسی (Viral Nervous Necrosis)

Abstract

بیماری نکروز عصبی ویروسی، یکی از مهمترین بیماری‌‌های ویروسی با گسترش جهانی در ماهیان دریایی و پرورشی دنیا محسوب می‌‌شود و تا به امروز بیش از 70 گونه حساس ماهی به این بیماری شناسایی شده است. هدف از این پژوهش ردیابی و شناسایی سریع ویروس مذکور با استفاده از روش Nested RT-PCR از بافت مغز کفال ماهیان دریای خزر بود. در طول فصل صید در سال 1395 تعداد 40 قطعه کفال طلایی (Liza aurata) در محدوده وزنی 50 تا 250 گرم با علائم مزمن بیماری از سواحل دریای خزر جمع آوری شدند و پس از جداسازی بافت مغز و استخراج RNA ویروس، با استفاده از روش ترانس کریپتاز معکوس، سنتز cDNA از روی RNA ژنوم ویروس صورت گرفت. سپس با روش Nested RT-PCR و با استفاده از دو جفت آغازگر اختصاصی F2/R3 و NF2/NR3 طی دو مرحله، قطعه مورد نظر تکثیر و توالی یابی شد. پس از بهینه سازی شرایط، واکنش PCR با استفاده از نمونه‌‌ی کنترل مثبت، در PCR مرحله ی اول (RT-PCR) در هیچ یک از نمونه‌‌های مشکوک کفال ماهیان باند مورد نظر مشاهده نشد. اما در دور دوم PCR (Nested RT-PCR ) در 20 مورد از 40 نمونه کفال ماهیان یک باند واضح bp 300 مشاهده شد. براساس نتایج بنظر می‌‌رسد که Nested RT-PCR می‌‌تواند به عنوان روشی مناسب برای تشخیص سریع سطوح پایین آلودگی و همچنین یک روش مناسب و کاربردی برای شناسایی ماهیان حامل آلوده و به ظاهر سالم در نظر گرفته شود. همچنین نتایج حاصل از توالی یابی نشان داد که ویروس مورد نظر در کفال ماهیان دریای خزر، متعلق به ژنوتیپ RGNNV می‌باشد.