استخراج و بهینه‌سازی تخلیص چند مرحله‌ای آنزیم تبدیل کننده آنژیوتانسین I(ACE) از ریه خرگوش

Abstract

آنزیم تبدیل کننده آنژیوتانسین I(ACE) یک پپتیدیل دی پپتید هیدرولاز است که 2 اسید آمینه انتهای کربوکسیلی(His-Leu) را از آنژیوتانسین I که یک دکاپپتید است جدا کرده و آنژیوتانسین II(یک اکتاپپتید) را تولید می‌نماید. به علت اهمیت ACE و مهارکننده‌های آن در بیماری‌زایی و درمان بیماری‌های قلبی عروقی مانند فشار خون بالا و نارسایی قلبی، تخلیص و سنجش آن علاوه بر ارزش علمی دارای اهمیت‌ بالینی و تجاری می‌باشد. با توجه به این مطلب، در مطالعه حاضر ACE از بافت ریه خرگوش به عنوان منبــع غنـی از ACE در 3 مرحله خالص گردید. برای استخراج ACE، پس از عمل هموژن کردن، از دترژنت غیریونی 40P-Nonidet استفاده شد سپس محلول استخراج شــده از دترژنــت، تحــت عمل رسوب‌دهی با سولفات آمونیوم با غلظت‌های اشباعی 50% و 70% قرار گرفــت. در مرحلــه بعــد محلول رویی به دست آمده توسط تبادل یونی با Q-Sepharose HP کروماتوگرافی شد سپس نمونه‌های دارای حداکثر فعالیت مخصوص آنزیم، توسط 200Sepharryl HR S تحت کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون قرار گرفتند. پس از این مرحله خالص بودن آنزیم با SDS-PAGE و PAGE تایید شد و وزن مولکولی آن 175 کیلودالتون تعیین گردید. فعالیت مخصوص نهایی به دست آمده برای ACE، 1/39 واحد در میلی‌گرم بود که به دنبال 651 برابر خالص‌کردن حاصل شده بود و بازده نهایی فرآیند تخلیص، 2/5% مشاهده شد. پس از تخلیص آنزیم، Km(michaelis constant) آن برای سوبسترای HHL(هیپوریل ـ هیستیدیل ـ لوسین)، 17/2 میلی‌مول محاسبه شد. مهار کننــده رقابتــی کاپتوپریــل توانست در غلظت‌های 1/0 تا 001/0 میلی مولار تقریباً ACE را به طور کامل مهار کنــد. PH اپتیمم برای ACE 3/8 محاسبه گردید. هم‌چنین بررسی اثر تغییرات دمایی، کاهش شدیــد در فعالیت آنزیم را در دمای بالاتر از 37 درجه سانتی‌گراد نشان داد. کاهش مراحل تخلیص و مــدت زمان لازم برای آن و نیز بازده مناسب به دست آمده، نتیجـه استفاده از رزین‌های با قدرت تفکیــک بهتـر و به کار گیـری سیستم FPLC(Fast Protein Liquid Chromatography) بود که در نهایت موجب بهبود و کاهش زمان فرآیند تخلیص چند مرحله‌ای ACE گردید.