ارزیابی کینتیکی آنزیم نیتریک اکسید سنتاز استخراج شده از کلیه گوسفند

Abstract

سابقه و هدف: نیتریک اکسید (NO) از طریق نیتریک اکسید سنتاز (NOS) و از ال- آرژینین تولید شده و در پروسه‌های فیزیولوژیکی و پاتولوژیکی متعددی از سیستم‌های بیولوژیکی نقش دارد. در این بررسی، فعالیت‌های کینتیکی NOS جدا شده از کلیه گوسفند مورد ارزیابی قرار گرفت. مواد و روش‌ها: با استفاده از تکنیک‌های هموژنیزاسیون، رسوب توسط سولفات آمونیوم و کروماتوگرافی ستونی روی DEAE-32سلولز و'2، '5-ADP-آگاروز، آنزیم NOS از 500 گرم از بافت کلیه گوسفند، جدا و خالص‌سازی شد. در هر مرحله از روند خالص‌سازی این آنزیم، مقدار پروتئین و فعالیت آن با استفاده از روش‌های برادفورد و گریس بررسی شد. یافته‌ها: در این بررسی، وزن ملکولی NOS کلیه گوسفند در الکتروفورزSDS-PAGE، 54 کیلو دالتون بود. فعالیت ویژه، 6/0 واحد بر میلی گرم پروتئین و بازده خالص سازی آن نیز 9/0 درصد (خلوص نسبی 20 برابر) به دست آمد. pH و دمای اپتیم این آنزیم نیز به ترتیب 4/7 و 30 درجه سانتیگراد به دست آمد و انکوباسیون پروتئین نشان داد که در محدوده دمایی 10 تا 30 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه، آنزیم پایدار می باشد. در غلظت 75 میکرو مول از سوبسترای ال-آرژینین، بیشترین فعالیت NOS مشاهده شد. Vmax و Km آنزیم به ترتیب 250 نانو مول در دقیقه در میلی‌گرم پروتئین و 32/5 میکرومول به دست آمد. استنتاج: نزیم NOS از کلیه گوسفند با خلوص نسبی 20 برابر خالص سازی شد و دمای اپتیمم، pH، غلظت مناسب سوبسترا، Vmax و Km آن به ترتیب 30 درجه سانتیگراد، 4/7، 75 میکرومول، 250 نانو مول در دقیقه در میلی گرم پروتئین و 32/5 میکرومول به دست آمد.