تأثیر کاهش حجم مخلوط واکنشی و افزایش سرعت آمپلیفیکاسیون DNA بر روی حساسیت تکنیک واکنش زنجیره پلیمراز

Abstract

چکیده در سالهای اخیر با وجود آنکه گزارش‌های رضایتبخش در بکارگیری PCR جهت تشخیص عفونتهای کلینیکی ارائه گردیده، معهدا این تکنیک هنوز نتوانسته بواسطه مشکلاتی نظیر هزینه بالا به آزمایشگاه تشخیصی راه پیدا نماید. معرفی PCR سریع در حجم‌اند و با استفاده از ترموسیکارهای مخصوص، سبب افزایش سرعت و کاهش میزان مواد مصرفی گردیده است. اما بکارگیری آن مستلزم برخورداری از دستگاهها و امکانات بخصوص بوده و در نتیجه نیازمند یک سرمایه گذاری اضافی برای آزمایشگاهها میباشد. در این مطالعه کاهش حجم مخلوط واکنشی با هدف افزایش سرعت و تقلیل هزینه مواد مصرفی با استفاده از ترموسیکلرهای معمولی و وسایل روتین آزمایشگاه مورد مطالعه قرار گرفت. ‌در این بررسی DNA مایکوپلاسما پنومونیه پس از تحت تأثیر قرار گرفتن با پروتئیناز K، با روش فنل کلروفرم خالص گردید. آزمایش PCR در حجم‌های متفاوت و برنانه‌های گوناگون انجام پذیرفت و محصول بدست آمده با ژل آگارز الکتروفرز آنالیز گردید. ‌نتایج حاصله در طی آزمایشات متعدد با حجم‌های متفاوت و برنامه‌های گوناگون لازم برای یک سیکل تکثیر تأیید نمود که حجم مخلوط واکنشی در لوله‌های معمولی آزمایش (ependorff) از ul ۱۰۰ به ul ۱۰ و همچنین زمان مورد نیاز از 5/6 دقیقه به 5/3 دقیقه برای هر سیکل تکثیر قابل کاهش بوده، بدون آنکه حساسیت تست کاسته گردد. در مرحله بعدی به منظور اطمینان از حساسیت شرایط جدید تست، روش مذکور با نمونه‌های کلینیکی که در حالت اصلی دارای نتیجه مثبت بودند مورد آزمایش قرار گرفت. کلیه نتایج حاصله نشان داد که تمامی نمونه‌های مثبت در حالت اصلی در حالت جدید نیز دارای نتایج مثبت بودند. انجام PCR در حجم‌های اندک، نه تنها سبب تقلیل هزینه انجام تست به میزان قابل توجهی میگردد بلکه میتواند سرعت انجام آمپلیفیکاسیون را به دو برابر افزایش دهد.