شناسائی ژن شیگاتوکسین به‌وسیله روش Multiplex PCR

Abstract

مقدمه: زیر گونه‌های Shiga toxin– producing E. coli) STEC ) و بیوتایپ 1 شیگلا دیسانتری باعث ایجاد اسهال، کولیت هموراژیک و ناهنجاری‌های بدخیم سیستم مجاری ادراری HUS ( Hemolytic Uremic Syndrome ) در انسان می‌شوند. بسیاری از نشانه‌های کل ی نیکی این بیماری در اثر تولید شیگا توکسین 1( Stx /Stx1 )، شیگا توکسین 2 ( Stx2 ) و یا مجموعه‌ای از هر دو نوع توکسین پدید می‌آید. این تحقیق جهت شناسا ی ی ژن این توکسین ‌ ها ب ه‌ وسیله روش ملکولی صورت گرفته است. مواد و روش کار: برای شناسا ی ی ژن‌های stx/stx1 و stx2 تکنیکی براساس Multiplex PCR به همراه ژن مالات دهیدروژناز ( mdh ) موجود در دو باکتری E. coli و شیگلا طراحی شده است. مجموعه‌ای از 6 پرایمر استفاده شده است: SFI و SRI یک قطعه bp 199 از ژن mdh را تولید می‌کنند که به ‌ عنوان یک کنترل مثبت ( Internal positive control ) برای صحت واکنش عمل می‌کند، Ka2R و Ka2F یک قطعه pb 381 از ژن stx2 را تولید و Ka1F و Ka1R یک قطعه pb 622 از ژن stx/stx1 را تولید کنن د. جهت تایید محصولات واکنش از فرآیند هضم آنزیمی و تعیین توالی استفاده شد. نتایج: محصولات PCR ژن‌های stx/stx1 و stx2 و mdh تنها در E. coli O157:H7 به ‌ طور هم ‌ زمان مشاهده شد و در بیوتایپ 1 شیگلا دیسانتری تنها قطعه مربوط به stx/stx1 و mdh مشاهده گردید . در ژنوم تخلیص شده از دیگر باکتری‌های گرم منفی قطعات مربوط به توکسین مشاهده نشد. فرآیند هضم آنزیمی و تعیین توالی صحت قطعات تکثیر شده را مورد تایید قرار داد. حساسیت واکنش PCR برای شناسا ی ی ژن شیگا توکسین pg/ m l 1/2 از ژنوم باکتری و معادل cfu/ m l 320 بود. بحث: واکنش طراحی شده قادر به شناسا ی ی ژن ‌ های stx2 , stx/stx1 و mdh می ‌ باشد. E. coli O157:H7 قادر به تولید هر دو نوع شیگا توکسین و بیوتیپ 1 شیگلا دیسانتری تنها قادر به تولید نوع 1 شیگا توکسین می ‌ باشند. با بررسی ‌ های انجام شده بر روی قطعات تکثیر شده و مقایسه آن ‌ ها با بانک ژنوم مشخص شد که قطعه در نظر گرفته شده برای تکثیر stx2 در تمامی انواع این ژن وجود دارد، در نتیجه جهت شناسایی آن ‌ ها مناسب می ‌ باشد. این روش وسیله ‌ ای مناسب جهت تشخیص انواع شیگا توکسین ‌ ها می ‌ باشد چرا که سریع، اختصاصی، حساس و ارزان می ‌ باشد.