مطالعه سه روش خالص سازی HBV DNA جهت استفاده در تکنیک PCR

Abstract

تشخیص هپاتیت B با توجه به فراوانی میزان عفونت ناشی از آن از اهمیت ویژه ای برخوردار است. در بین روشهای تشخیصی، اخیرا تکنیک PCR بیش از پیش مورد توجه قرار گرفته است. گزارش های ارائه شده در مراکزی که از این تکنیک استفاده مینمایند حاکی از وجود برخی از موارد منفی کاذب میباشد. هدف از انجام این مطالعه بررسی مقایسه ای بین روشهای خالص سازی رایج میباشد تا ضمن آگاهی از میزان کارایی هر یک بهترین روش شناسایی گردد.

از 30 نمونه دریافتی از بیماران مراجعه کننده به درمانگاه هپاتیت بیمارستان شریعتی تهران که مبتلا به هپاتیت مزمن بوده و HBs آنتی ژن مثبت و HBe آنتی ژن منفی بودند نمونه سرم تهیه گردید. استخراج HBV DNA با سه روش توسعه یافته جوشاندن بعنوان یک روش سریع، روش فنل کلروفرم بعنوان یک روش دقیق، و روش خالص سازی مبتنی بر گوانیدیوم هیدروکلراید انجام گردید. کیتPCR برای تشخیص هپاتیت از شرکت سیناژن استفاده گردید که شامل آنزیم taq پلیمراز و مخلوط واکنشی متشکل از پرایمر dNTP و بافر واکنش بود. پروتکل PCR مزبور قادر به تکثیر محصولی به طول bp 353 بود. سپس با چرخه گرمایی مناسب نمونه ها با واکنش PCR تکثیر گردید و محصول PCR در سه روش مقایسه شد.

نتایج بدست آمده در مرحله اول موید موفقیت پروتکل استفاده شده در تشخیص DNA هپاتیت B در سرم بود. همچنین میزان موارد مثبت روش جوشاندن ، روش فنل کلروفرم و کیت خالص سازی به ترتیب 19،16 و 23 و موارد منفی به ترتیب 14، 11 و 7 مورد بود.

روش PCR سریعترین و دقیق ترتین روش جهت شناسایی بیماران بوده و روش تخلیص DNA توسط گوانیدیوم هیدروکلراید در ویروس ها موفقیت آمیز ترین روش بکار رفته در این بررسی است.