تعیین نیمه کمی میزان بیان mRNA اینترفرون گاما با استفاده از روش RT-PCR

Abstract

سایتوکاینها واسطه های شیمیائی هستند که از سلولهای سیستم ایمنی ترشح شده، و بر سلولهای دیگر یا خود سلول ترشح کننده اثر می کنند. بیان متفاوت ژن سایتوکاینها در بدن مشخص کننده نوع پاسخ ایمنی (از نوع Th1 یا Th2) است که خود این پاسخ متفاوت می تواند نقش مهمی در پاتوژنز بیماریها داشته باشد. از عمده ترین سایتوکاینهای سلولهای Th1 می توان به IFN-γ و IL-2 اشاره کرد. که در پاسخهای ایمنی علیه پاتوژنهای داخل سلولی شرکت می کنند. با توجه به اینکه بیان ژن سایتوکاینها منجمله اینترفرون موقتی بوده و در یک مدت زمان محدود می باشد ، به این علت لازم است بیان ژن آنها (مقدار mRNA) توسط روشهای حساس و دقیقتری همانند RT-PCRاندازه گیری شود .بعلاوه تعیین زمان مورد نیاز جهت ماگزیمم بیان ژن می تواند در مطالعات کلونینگ و استعداد ابتلا به بیماریها در بعضی ازافراد کاربرد داشته باشد.

بعد از کشت لنفوسیتها در حضور PHA (Phytohaemagglutinin) ( با غلظت 1μg/106cell ) در زمانهای متفاوت (72،0،4،8،12،24،48 ساعت) و استخراج RNA توتال از آنها و سنتز cDNA تک رشته ای اقدام به انجام RT-PCR شد. چون در تمام ساعات انکوبه جواب مثبت بود لذا در مرحله بعدی اقدام به تیتراسیون cDNAحاصل با ضریب رقت 1.2 (رقتهای متوالی 1.2، 1.4، 1.8،و….) شد. بر روی ژل الکترفورز (2%) قطعه مورد نظر (273bp ) مشاهده شد.

نتایج بدست آمده از RT-PCR و Semi-quantitative-RT-PCR نشان می دهد بعد از چهار ساعت انکوباسیون لنفوسیتها با PHA ، بیشترین بیان ژن را دارند (تیتر cDNA=512) و معمولاً بعد از گذشت 24 ساعت مقدار آن به سطح اولیه (قبل از تحریک) بر می گردد.

با توجه به نتایج فوق و مقایسه آن با نتایج محققین دیگر می توان گفت روش RT-PCR حساسترین روش سنجش بیان ژن جهت سایتوکاینهاست و بیان ژن اینترفرون بعد از گذشت چهار ساعت انکوبه به ماکزیمم می رسد. بنابر این مدت زمان انکوباسیون با PHA جهت بررسی اثر عوامل مختلف بر تولید و بیان ژن اینتر فرون گاما زمان ایده آلی است.