آنتاگونیست رسپتور اینترلوکین-1 انسانی: کلونینگ، بیان و بهینه سازی در میزبان E.coli

Abstract

مقدمه و هدف: آنتاگونیست رسپتور (IL-1Ra) IL - 1 یک سایتوکاین ضد التهابی قوی است که باعث محدود کردن اثرات التهابی مربوط به اینترلوکین-1 (IL-1) می شود. بعلت تشابه ساختمانی با IL-1Ra، IL-1 به طور رقابتی به رسپتور IL-1 متصل می شود ولی هیچ سیگنالی را القا نمی کند. بنابراین در درمان افراد مبتلا به بیماری های التهابی نظیر آرتریت روماتوئید بکار می رود. هدف از مطالعه حاضر کلون کردن، بیان و بهینه سازی بیان این پروتئین در E. coli می باشد. روش کار: دراین مطالعه تجربی قطعه ی ژنی سنتزی مربوط به IL-1Ra به وسیله PCR تکثیر داده شد. پس از برش دو آنزیمی، این قطعه در وکتور بیانی pET28a کلون گردید. بیان ژن مورد نظر ابتدا در سطح mRNA به روش RT-PCR و سپس در سطح پروتئین به روش SDS-PAGE مورد برسی قرار گرفت و برای تایید پروتئین بیان شده از وسترن بلات استفاده گردید. بهینه سازی بیان نیز در غلظت های مختلف IPTG و مدت زمان های مختلف بعد از القاء صورت گرفت. نتایج: به کمک روش کلنی-PCR و هضم دو آنزیمی، کلون شدن قطعه ی ژنی مورد نظر در وکتور بیانی pET28a مشخص شد. رونویسی از ژن کلون شده و بیان بالای پروتئین نوترکیب به ترتیب به روش RT-PCR و SDS-PAGE مشاهده شد. نتیجه ی حاصل از الکتروفورز پروتئین نیز با روش وسترن بلات تایید گردید. میزان بیان در غلظت های مختلف القاءکننده و مدت زمان پس از القاء بهینه سازی گردید. نتیجه نهایی: نتایج حاصل از مطالعه نشان دهنده ی بیان بالای این پروتئین در میزبانE.coli به وسیله وکتور بیانی pET28a بود. این مطالعه هم چنین نشان داد رابطه مستقیمی با افزایش بیان و مدت زمان برداشت سلول ها پس از القاء وجود دارد، لذا القاء با غلظت 1 میلی مولار IPTG به مدت یک شب برای بیان بالای پروتئین پیشنهاد می گردد.