مهندسی آنزیم درمانی اوریکاز آسپرژیلوس فلاووس با استفاده از روش جهش‌زایی هدف‌دار

Abstract

پیش‌زمینه و هدف: آنزیم اوریکاز آسپرژیلوس فلاووس (EC 1.7.3.3) به‌عنوان یک آنزیم دارویی دارای کاربردهای درمانی ازجمله کاهش اورات سمی بوده و در درمان بالینی اختلالات نقرس، نفروپاتی و هایپراوریسمی ناشی از سندروم لیز توموری (TLS) استفاده می‌شود. علی‌رغم داشتن تمایل و ویژگی بالا در تبدیل سوبسترا به محصول، پایداری کم آن در برابر حرارت، کاربرد آن را با محدودیت مواجه ساخته است. برای حل این چالش راهکارهای متعددی وجود دارد که ازجمله آن‌ها می‌توان به مهندسی پروتئین و دستکاری ژنتیکی اشاره کرد. هدف از این تحقیق طراحی و ایجاد پل‌های دی‌سولفیدی برای اولین بار در آنزیم اوریکاز می‌باشد. مواد و روش‌ کار: در این تحقیق با استفاده از مطالعات بیوانفوماتیکی و سرور‌های موجود و با در نظر گرفتن کد pdb 1xxj، موقعیت‌های صحیح برای ایجاد پیوند دی‌سولفیدی در آنزیم اوریکاز انتخاب شد. سپس با روش جهش‌زایی هدف‌دار و روش SOE-PCR جهش‌های انتخابی ایجاد شدند. یافته‌ها: شش جایگاه احتمالی تشکیل پیوند دی‌سولفیدی گزینش شد که شامل سه پیوند دی‌سولفیدی داخل زنجیره‌ای و سه پیوند دی‌سولفیدی بین زنجیره‌ای شامل Ser 145-Thr 185، Ala 235-Val 248، His 256-Gln 281، Ala 6-Cys290، Ser282-Ser282، Asn12-Asp283 می‌باشند که با جهش دادن آن‌ها به سیستئین پیوند دی‌سولفیدی تشکیل می‌شود. در این پروژه نتایج حاصل از SOE-PCR و کلونینگ برای جهش نقطه‌ای Ala6 و Ser282 با موفقیت توسط روش‌های کلونی PCR و هضم آنزیمی و درنهایت تعیین توالی، تأیید شدند. بحث و نتیجه‌گیری: در این تحقیق با موفقیت مکان‌هایی برای جهش به اسیدآمینه سیستئین تعیین شد و توسط روش SOE-PCR با موفقیت جهش‌زایی انجام شد.