کلون سازی کاسپاز۹ در وکتور یوکاریوتی، بررسی بیان و سنجش عملکرد آن در سلول

Abstract

اهداف: مرگ سلولی برنامه ریزی شده فرایند مهمی است که طی تکامل بدون تغییر باقی مانده است. این فرایند در تنظیم شرایط فیزیولوژیکی و پاتوفیزیولوژیکی موثر است. آپوپتوز شناخته شده­ترین نوع مرگ سلولی است که در بسیاری از تومورها مختل شده و سبب مقاومت به درمان می شود. کاسپاز9 یکی از پروتئین­های کلیدی مسیر میتوکندریایی آپوپتوز است. فعال شدن کاسپاز9 منجر به فعال شدن کاسپاز­های اجرایی مانند کاسپاز3/۷ شده و با راه اندازی آبشار کاسپازی منجر به مرگ سلول می­­شود. در این مطالعه، ژن کاسپاز9 در وکتور یوکاریوتی pcDNA3.1(+) کلون و عملکرد آن در سلول­ بررسی شد. مواد و روش­ها: ژن کاسپاز9 طی PCR با پرایمر­های اختصاصی تکثیر و پس از هضم دوگانه با آنزیم­های KpnI و BamHI به پلاسمید pcDNA برش خورده الحاق شد. پلاسمید نوترکیب حاصل پس از تعیین توالی به رده سلولی SH-SY5Y ترنسفکت و با داروی دوکسوروبیسین تیمار شد. عملکرد آن بر مرگ سلولی با روش رنگ آمیزی تریپان بلو و PI، و سنجش فعالیت کاسپاز۳ بررسی و بیان آن در سلول با وسترن بلات تایید شد. یافته ها: کلونینگ ژن کاسپاز9 انجام و بیان آن در سلول با وسترن بلات تایید شد. افزایش بیان کاسپاز۹ در سلول منجر به پردازش خود بخودی آن طی همودایمریزاسیون و در نتیجه القای مرگ سلولی شده و حساسیت سلول نسبت به دوکسوروبیسین را افزایش و زنده مانی سلولی را کاهش داد. نتیجه گیری: ژن کاسپاز9 کلون شده در سلول فعالیت نشان داد و آپوپتوز را در حضور دوکسوروبیسین از طریق خود فعال­سازی و متعاقبا تشدید فعال­سازی کاسپاز۳ افزایش داد.